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标题:【求助】 PCR条件的设计

mingming0638[使用道具]
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发表于 2015-3-10 14:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】 PCR条件的设计


我刚开始做pcr实验，想知道PCR变性、退火、延伸的温度条件该怎么设计，这三种温度对PCR过程或者结果会产生什么样的影响？希望前辈指点一下。
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dreaming[使用道具]
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发表于 2015-3-10 14:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

变性一般94-96度，这个温度是把双链DNA打开，而退火是引物与模板结合一般55-65度，具体的温度根据你的引物的Tm值来确定，一般使用60，延伸温度是根据酶来确定的，Taq酶的最佳活性温度是72度，所以Taq酶72度延伸；而pfu高保真酶的最佳活性温度是68度，所以68度延伸
希望对你有用！
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kewanqi2011[使用道具]
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发表于 2015-3-10 14:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以去生物论坛上找资源  很多的    楼上说的很对
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nikonun[使用道具]
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发表于 2015-3-10 14:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

热变性的目的是将双链DNA解链为单链DNA，使在引物与模板能够退火为双链，延伸是再上面的基础上DNA Polymerase进行的聚合反应；而热变性的温度大多采用93~95℃（Taq酶在95℃的半衰期只有20min，94℃的半衰期是40min，大多数都采用94℃），在这个温度下dsDNA完全能够解链为dsDNA；退火的温度要根据引物的Tm值而定，一般采用Tm-3~5℃的温度做退火（其实Tm值仅仅是个参考，还和引物的结构有关）；延伸温度是由你使用的聚合酶而定，普通的Taq酶的话就用72℃就可以了。
希望对你有所帮助!
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49888[使用道具]
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发表于 2015-3-10 14:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
主要是退火温度和延伸时间，退火温度有引物决定，延伸时间由扩增片段大小决定

[ 本帖最后由 49888 于 2015-3-10 14:25 编辑 ]
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u234[使用道具]
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发表于 2015-3-10 14:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
变的只有两个嘛。。。退火温度（比Tm小5°），二是延伸时间（据说按照1000bp：1分钟这个比例计算），，，，其他都基本一样滴啦~~如果你不知道引物对应的退火温度，需要探索，建议温度梯度PCR，来探索最佳条件~~
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