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标题:【求助】 ISSR标记，PCR结果大家帮忙给分析一下吧

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发表于 2015-3-10 15:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】 ISSR标记，PCR结果大家帮忙给分析一下吧

大家帮我看看，我做得是ISSR分子标记，扩增出来总是这样，带不是很亮，几次了很郁闷，扩增上四五个样的时候，带有时候也挺亮，可是稍稍一多就不行了。帮我分析一下！！

再补充一下，我的DNA有较多糖，但是我用CTAB法提取，怎么也除不干净。我觉得这个有点影响我的pcr。


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发表于 2015-3-10 15:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大家帮我看看，我做得是ISSR分子标记，扩增出来总是这样，带不是很亮，几次了很郁闷，扩增上四五个样的时候，带有时候也挺亮，可是稍稍一多就不行了。帮我分析一下！！
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发表于 2015-3-10 15:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.markers都未能跑好，凝胶浓度可能欠缺，在1.5%左右较好，现配现用
2.PCR体系用高质量的聚合酶，如Ex Taq可能效果更好.
3.ISSR对DNA模板质量要求高，最好没有降解的DNA
4.PCR循环数在35个左右，延伸时间根据条带大小控制在1Kbt条带在1min左右，不宜过长时间，退火温度要进行梯度优，确定最优温度
（以上纯属个人经验，希望能帮到你）
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发表于 2015-3-10 15:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做的胶是2%的，跑的还可以。你不妨试试。100v电压。
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发表于 2015-3-10 15:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

同门的留学生在做ISSR，关注一下，呵呵
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发表于 2015-3-10 15:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人认为是胶的问题，我也用的2%，可以用着试试。
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发表于 2015-3-10 15:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

怎么Marker 就没有跑好呀 ，是不胶的问题
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发表于 2015-3-10 15:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最大的原因应该是胶，可能不太均匀……顺便确认一下跑胶的时候的其他条件吧
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发表于 2015-3-10 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可能是你用的酶保真不好 你可以换一下 还可以调整一下退火温度
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发表于 2015-3-10 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

退火温度要进行梯度优化，2%的胶
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