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标题:【求助】 PCR几天了无果，分析了一些可能的原因仍得不到...

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发表于 2015-3-10 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】 PCR几天了无果，分析了一些可能的原因仍得不到...


本人要从一个细菌中P出一段酶的基因片段，长度约为2000bp片段如下
tcagctcgagtgctttacgtcgagcttgtacaacttgaccagcgcgctggtgtccgacccgtcagcctggcggtcctgcaagtaattgcccgccttgaaatagaacttcaggtctttccagccggcgtccttggcgacgaaatcgacggtcttggtctgcccgttgaccgtcatcgacaacacaccgtccaccactttgatctgcgcatcgtacggcttgcccagttcgatgccttcgaacacgtagtgcgtgtccttgccgccagcggccgagttcttcacaagaaaatccagcgtgttcttgtagaactgccccttgaccagcggcggcgcattcgagccatcgggcatgacggcatgaatctgcatgacaatggtcttgccactgggcgacacgtgcatcaccgctccgcgcagattcatttcgtgggtgccttgccagccccaattcaccgcgtggttgtcgggatcgagcatttcgcgcagctcgctgcgcgggtacttcgtgttggccgtcgtcttgaaaccgctggccggacaccagaaggcaagcgagccatccttgtcgacgtagaagtacttgtcctgataacccttgagcagatcacgcgtggcgacatcgatcgggtcgaccggaatctgcagcttccacttcgacaggtcgatcgacgaatgcgccgctgccggggcggacaccggcgcctgcgctgccgcgccttgcggtttgtacgccagcaaagtgcccgaaccaccggtacgcggatcgaagatcggcaccgtcatgaagcccagctcatcggcaaaaccaaagcgcgcgcgctggtattcgatccagttcaggtcgccccgccccggcttgaaggcacgcgtatcctgcggctcggaagcgtacttcttgatgaggtccgggttcttcaccgcagcaaagacaaacttgcgcgctgagtgaatatcgcgaccgttctctttgtacgcgtacagatcgataccctgacgtgatgccgtttcggcaatcatcgtcagcggcagcatggcgtagttctgatagtgcaaggactgttcgtgacgcgtcatttcatgcacgaagctgccgtcttcattgatcagccccatcgcctgcacataacggcccagcccccaacggaagagttcatcgtccttgctgatcacgccgatgatggtcgcttcctgaccgcgccaatacgagtgattgttgcagcaactcgtgtcgccccccggaaagctcgtctgatggcgcgccacacggttgagccacttcaccacacgctcgcgctgggctgtgtcgacgttcggctcggccatcatcgtcgacagggcaaaggcggcggtcgccgccgaccattcgacttggtaccacgactgcgacttggggtcgtagttgagcaacgcgtcggccttggcccacttgtccagcatgttcagcagacaagtggcgtacaccggcttgcccgtcgcaacgtagagatttccaagcgtggcggaaattttctcgaaatcacgataaagcgtcaccaccggttcgtagtccggattcaccgggccgtgattgccggaaagataacggcgcggaatgaccatctcgccttgctgcgggttaggcgttgcctcggtcgtgcagtcgtactccttgggcagcgctgccttgaggcggtcatcgagctgcccgctctgcaagaaggtacgacgcgccttgacgtcgacatacgaggccgtggggtctttcacgacggcctggtcgaaggggtgtgcctgcaggctgcccgcgaaggcacaacctgcgaacgcaagcgcggcgacggccagacgacggccatgccccgggaacgggatgtcaaacatcgaactgtctccagatttttcgcgcgcagcccccacgcgcgtcgttgcaaggcatgccaaaggcat
之前根据文献中的引物扩出了改基因片段中绝大多数片段，但最后100+bp的碱基未P出来，怕到时候表达不出来，所以重新设计了引物如下：
正向引物：5'-CCG GGATCC TCAGCTCGAGTGCTTTACGTC-3’
[G+C]%    =   52.38 Tm(NN)    =  60.970 degree(C)
反向引物：5’-TAT GCGGCC GCATGCCTTTGGCATGCCTT-3’
[G+C]%    =   50.00  Tm(NN)    =  59.315 degree(C)
并设计了酶切位点跟保护碱基，上面的TM值为未加酶切位点及保护碱基时用引物分析得知的，加了酶切位点跟保护碱基后两条引物的TM值在70左右，非常接近.
之后进行pcr
反应体系为：
引物1（10uM）：0.5ul
引物2（10uM）：0.5ul
模板：1ul
10*Taq plus Buffer：2.5ul
dNTP Mixture（2.5mM）：2ul
Taq plus（2.5U/ul）：0.5ul
水：18ul
总计：25ul体系
PCR条件
94℃：5min
94℃：30s
退火温度55℃：30s
延伸温度72℃：2min
72℃：10min
4℃：∞

跑出来的条带如下：


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附件
2015-3-10 15:50
20120627海藻酸裂解酶克隆（失败）.jpg (12.93 KB)
 
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发表于 2015-3-10 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
泳道1：Mark（2000bp）目标条带大小2000左右
泳道2：水

从图中可以看出基本是- -没跑出来，就跑出点引物了
之后进行了梯度PCR
退火温度范围53-67℃都做了，结果差不多- -
之后单独跑了引物，引物没降解、没污染
用之前的引物重新P了一次，可以P出目的条带，说明基因组是完好的
酶是新买的
请教各位高人帮我分析下，实在是绞尽脑汁无能为力了.T.T
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wanglaoshi[使用道具]
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发表于 2015-3-10 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主能不能把酶告诉我，有的时候用taq系列p能出来，而高保真的不能，还有你的基因可靠吗？如果根据其他菌设计的基因，很有可能你查到的基因就不对，还有第二三个用道有错配，提高温度不行，估计引物太差
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发表于 2015-3-10 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 wanglaoshi 于 2015-3-10 15:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主能不能把酶告诉我，有的时候用taq系列p能出来，而高保真的不能，还有你的基因可靠吗？如果根据其他菌设计的基因，很有可能你查到的基因就不对，还有第二三个用道有错配，提高温度不行，估计引物太差 ...

我用的是天根的taq plus，主要是为了方便之后的T-A克隆，引物是根据一个与我实验菌株相似度98%的菌株中的一个酶片段设计的，这个酶已经有文献试验过了，应该可靠.
我试了试用之前的正向引物跟我新设计的下游引物去扩……在54℃，55℃都扩出来了，且特异性比较好，难道是我新设计的正向引物有问题？附新旧正向引物对比：
旧正向引物：5‘-CC   GGATCC TCAGCTCGAGTGCTTTACGTCGAG-3’
新正向引物：5'-CCG GGATCC TCAGCTCGAGTGCTTTACGTC-3’

区别就是保护碱基多设计了一个G，比旧正向引物少设计了3个碱基GAG.
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nut6694[使用道具]
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发表于 2015-3-10 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 百分比 于 2015-3-10 15:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我用的是天根的taq plus，主要是为了方便之后的T-A克隆，引物是根据一个与我实验菌株相似度98%的菌株中的一个酶片段设计的，这个酶已经有文献试验过了，应该可靠.
我试了试用之前的正向引物跟我新设计的下游引物去扩……在5 ...

反向引物我好像用你的基因找不到对应的，还有我算出正向引物是58度，你原先多了三个碱基，现在少了三个退火温度应该下降了，可能与你原先的相差大于2度了，这个你在看看
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发表于 2015-3-10 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也是刚刚做这个 如果你换了引物 必须要从新摸条件的 你应该好好的摸一下条件 如果你用的 没问题的话 在耐心一点 一定会出的
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发表于 2015-3-10 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 wanglaoshi 于 2015-3-10 15:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主能不能把酶告诉我，有的时候用taq系列p能出来，而高保真的不能，还有你的基因可靠吗？如果根据其他菌设计的基因，很有可能你查到的基因就不对，还有第二三个用道有错配，提高温度不行，估计引物太差 ...

为什么有时候Taq酶可以扩出来，高保真不行呢。。。
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 小中大

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发表于 2015-3-10 15:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Plus 酶不太好，最好是用Takara的 LA taq酶，我P的1960多的片段就没事的！我觉得你的退火温度有点高了！一般在50°-65°之间最好！高于65°酶的活性不太好！
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发表于 2015-3-10 15:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你直接用加酶切位点的引物在细菌中扩，是不是有点难度啊，因为两端的酶切位点和保护碱基在细菌基因中是不存在的，有可能引物结合很困难。如果你不加酶切位点，先用一般的引物把你所要的片段试着扩出来，可能会容易一些，然后连到载体上，以载体为引物，用加酶切位点的引物来扩你所要表达的序列。祝你好运！
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