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标题:【求助】实时荧光定量结果分析求助~~

qiangren789[使用道具]
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发表于 2015-3-10 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】实时荧光定量结果分析求助~~

下图为实时荧光定量的溶解曲线图，有哪些原因会出现这个情况，特别是除引物因素以外的原因，谢谢~~


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2015-3-10 17:30
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mercedes[使用道具]
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发表于 2015-3-10 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
模板是否降解，pcr条件还需优化，引物特异性如何？
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发表于 2015-3-10 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果模板是基因组的话，扩20ul体系试试。一般模板是cdna的话，我们实验室一般用10ul体系。我用基因组做模板，用10ul体系很不稳定，后来改成20ul体系挺稳定。
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发表于 2015-3-10 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

主要是引物的原因。除此之外，Mg离子浓度过高（最适浓度为2.0 mmol/L）、dNTP浓度过高（最适浓度200 uMol/L）、使用酶的质量、退火温度偏低都有可能产生非特异扩增。
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发表于 2015-3-10 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
主要是双峰吧？呵呵~~可以用特异性更强的酶试试~~
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发表于 2015-3-10 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

CT值是多少？做什么项目？引物是否已经BLAST
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发表于 2015-3-10 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是否是有基因组的污染或者引物的污染
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发表于 2015-3-10 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

基本上就上面的同道所提到的那些原因吧
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qiangren789[使用道具]
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发表于 2015-3-10 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 wu11998866 于 2015-3-10 17:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

如果模板是基因组的话，扩20ul体系试试。一般模板是cdna的话，我们实验室一般用10ul体系。我用基因组做模板，用10ul体系很不稳定，后来改成20ul体系挺稳定。 ...

我用的是CDNA为模板，非常感谢你的帮助，我想请问一下，为什么10ul的不稳定，20ul就能够稳定，有什么原因导致这种结果吗？
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qiangren789[使用道具]
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 小中大


QUOTE:
原帖由 王薇薇安 于 2015-3-10 17:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

主要是引物的原因。除此之外，Mg离子浓度过高（最适浓度为2.0 mmol/L）、dNTP浓度过高（最适浓度200 uMol/L）、使用酶的质量、退火温度偏低都有可能产生非特异扩增。 ...

我使用的是生工的PCR快速扩增试剂盒，这样的试剂盒有办法降低Mg离子浓度吗？
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