【求助】定点突变

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标题:【求助】定点突变

prettygirl@[使用道具]
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发表于 2015-3-10 17:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谁用过GB-Mut定向突变试剂盒做定点突变？
我最近做是都没有变回来。我的基因长3kb,质粒4kb，共7kb,有一个点突变，设计引物按要求来的，可是没有变回来。求解

附件

2015-3-10 17:41

未命名 (1).JPG (41.01 KB)

bongte[使用道具]
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发表于 2015-3-10 17:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不好意思，没太看懂你的图，哪个部分点突变？中间部分？

prettygirl@[使用道具]
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发表于 2015-3-10 17:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这个图，是有两个突变点
设计3对引物，引物引进了正确的碱基，然后分别扩增出这3段，再利用同源重组把这几段拼接起来。

bongte[使用道具]
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发表于 2015-3-10 17:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 prettygirl@ 于 2015-3-10 17:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
这个图，是有两个突变点
设计3对引物，引物引进了正确的碱基，然后分别扩增出这3段，再利用同源重组把这几段拼接起来。

哦，你1楼说有1个点突变。。
扩增3次，再同源重组？你的工作量挺大啊，而且风险也不小。

没有变回来应该是没有同源重组

prettygirl@[使用道具]
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发表于 2015-3-10 17:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 bongte 于 2015-3-10 17:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

哦，你1楼说有1个点突变。。
扩增3次，再同源重组？你的工作量挺大啊，而且风险也不小。

没有变回来应该是没有同源重组

我在做2个基因，一个基因一个突变，一个2个突变。所以一个突变的是要扩增2段在和酶切开的质粒重组。二个突变的是扩增3段和酶切开的重组。理论是这个样子的，说明书上也是这样说的长出的克隆是95% 是要的。可是板上没找到一个是变回来的克隆。

DNA[使用道具]
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发表于 2015-3-10 17:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 prettygirl@ 于 2015-3-10 17:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我在做2个基因，一个基因一个突变，一个2个突变。所以一个突变的是要扩增2段在和酶切开的质粒重组。二个突变的是扩增3段和酶切开的重组。理论是这个样子的，说明书上也是这样说的长出的克隆是95% 是要的。可是板上没找到 ...

那你筛选呢？只能测序？

prettygirl@[使用道具]
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发表于 2015-3-10 17:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 DNA 于 2015-3-10 17:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

那你筛选呢？只能测序？

是呀，就是先挑大小是我要的质粒，然后送测序呀

tuomu45[使用道具]
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发表于 2015-3-10 17:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

工作量大，风险系数高不支持。

鸽子不哭[使用道具]
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发表于 2015-3-10 17:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你能挑到片断大小符合预期的,说明连接效率和片断组装都很成功. 唯一可能的原因是你的突变PCR没有做好,突变位点没有引入PCR产物. 可能的原因是:
1. 引物设计有问题.突变为点建议在中间,不能在靠近3'末端,因为Pfu有外切功能
2. 引物合成必须用PAGE纯化. 现在引物合成的质量参差不齐, 必须要用PAGE纯化的才能保证结果

如果突变PCR做好,那基本是没有问题的.