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标题:【求助】请大家看一下我的PCR结果，目标2000bp,..

ukonptp[使用道具]
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发表于 2015-3-10 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请大家看一下我的PCR结果，目标2000bp,..

问答如题。
之前曾经扩增出来目的片段多次，后来cDNA用完，又换了新的cDNA,结果重复多次出现这样的条带，在加样孔边上，跑不下来。
用的Pfu。pcr条件为 95度 30s, 63度30s 68度3min。
这条片段中间包括一些重复序列，大概20多个bp左右的序列，间隔出现多大50次以上，这个会是造成超级条带的原因吗？如果是，为什么之前可以扩增出来目的片段呢？
会是cDNA的原因吗？因为已经换过3次cdna，还是出现这样的结果。
请大家支招。

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remenb[使用道具]
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发表于 2015-3-10 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
会不会是没扩出来你的目的片段，而堵在孔里的是因为模板肽浓的缘故？
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2015-3-10 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
第一次图片没传成功。根据图片显示，不太可能是模板太浓。如果是模板浓到一定程度的话也不应该是尖锐的大型条带。并且此条带非常亮。
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发表于 2015-3-10 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我之前也遇到过类似情况，后来，把电泳槽中的TBE全换新的，换新胶，最重要的是，将Taq换掉，后来就好了！你试试看，因为可能的原因太多了，最好把引物也重新换一下，重新稀释一下，还有Taq buffer
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发表于 2015-3-10 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 www.1 于 2015-3-10 17:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我之前也遇到过类似情况，后来，把电泳槽中的TBE全换新的，换新胶，最重要的是，将Taq换掉，后来就好了！你试试看，因为可能的原因太多了，最好把引物也重新换一下，重新稀释一下，还有Taq buffer ...

不太懂，听来好像问题挺大的！
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831226[使用道具]
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发表于 2015-3-10 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

电泳肯定没有问题，marker跑的很好；这个条带根本就不是核酸物质，你用你的模版跑个电泳看看，可能有蛋白质污染。
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2015-3-10 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 831226 于 2015-3-10 17:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

电泳肯定没有问题，marker跑的很好；这个条带根本就不是核酸物质，你用你的模版跑个电泳看看，可能有蛋白质污染。

我想能排除各种试剂污染的问题，因为我已经都换了新的。并且请同一个实验室的老师用他的各种试剂为我做了一遍也会出现相同的结果。我会用模板跑个电泳试试但是不抱希望。因为右边的那个孔的模板是以前成功的时候割胶回收的dna稀释了300倍。并且割胶回收后为了检验回收效率也是跑了电泳的，并没有出现超级条带。
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发表于 2015-3-10 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你这个现象是典型的挂孔，我看了一下这么多人回复，你的问题应该是出在模版上面，你可以取1UM.2UM.4UM这样的梯度跑下电泳（模版），应该是模版太多，并且你的重复比较多，重复太多的话就会出现非特异性扩增，意思就是说本来你只有100bp，但是由于序列很相似，本来到100的时候就应该结束，你的并没有结束，二十有另外的一个或者多个100的条带跟在了其中一个目的条带后面。简单来说，就是你扩出来的东西很可能是很多很多你需要的条带连在了一起，就出现了这种大的条带。
我个人的建议是：把基因分开，设计酶切。或者设计退火。
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发表于 2015-3-10 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

胶跑了多久啊？是不是胶浓度的问题，加的marker是小片段？？？
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sistis[使用道具]
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发表于 2015-3-10 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

第一，做个阳性参照如内参之类的引物跑跑看
第二，跑模板
第三，降落pcr
感觉还是引物问题可能性比较大，可能是P的过程形成了很多条带，所以电泳各个片段不能向另一极涌动而聚集在点样孔中，可能就是所谓的挂孔吧。专业术语不会说，但是遇到过
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