PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】 PCR产物量求助。。求大虾建议。。

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 19  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】 PCR产物量求助。。求大虾建议。。

阿拉蕾[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 69963
精华 0
积分 511
帖子 701
信誉分 100
可用分 4251
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-3
状态 离线
1

发表于 2015-3-10 22:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】 PCR产物量求助。。求大虾建议。。

最近在做pcr关于PCR体系的最适条件摸索。。小弟初始接触PCR。。
请大侠们指教下在摸索过程中少走弯路的建议。。谢谢！
这是上次做的PCR的退火梯度温度依次是（56,55.4,54.4,52.8,50.9,49.5,48.5,48.0），
目的条带有430个bp,效果感觉产物好少，Marker也跑得不亮。。。
（图片中共2个样，前8个是一个样的梯度，后八个是另一个样的梯度，maeker用的是DL2000）


查看积分策略说明
附件
2015-3-10 22:25
GHRH_E2 20120513.jpg (27.37 KB)
 
顶部
阿拉蕾[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 69963
精华 0
积分 511
帖子 701
信誉分 100
可用分 4251
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-3
状态 离线
2

发表于 2015-3-10 22:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
PCR体系如下（25微升）：                              PCR循环如下：
ddH2O:10.1                                                     95℃  5min
mix:13.0                                                          95℃  1min                   ━┓
P上：0.5                                                          TM(梯度56-48)  1min       ┃*35循环
P下：0.5                                                          72℃ 50s                      ━┛
DNA:0.8                                                           72℃ 10min
Taq酶：0.1

PCR产物如上图，是不是模板加少了？使PCR产物量不高？
此外，引物报告单给的TM是50.7-48℃
生物秀卧虎藏龙，求各位大大解答。鄙人不胜感激。
第一次发帖，排版不好，见谅……谢谢大家！
顶部
jiushikeshui371[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108894
精华 1
积分 312
帖子 299
信誉分 102
可用分 2258
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
3

发表于 2015-3-10 22:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议引物pcr温度提高点，2度一个梯度，模板可以多加点，产物不多会不会是酶的问题，taq系列酶的话，应该会很亮的，pfu的话正常
顶部
newway[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76575
精华 0
积分 505
帖子 689
信誉分 100
可用分 4253
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态 离线
4

发表于 2015-3-10 22:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的mix中没有酶的吗？如果没有可以加0,2ul试试。模板可以找一个你觉得比较好的温度（按上面的那个用56就可以）做一个梯度找出最适浓度啊，pcr体系中离子浓度高了也会影响的。
顶部
阿拉蕾[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 69963
精华 0
积分 511
帖子 701
信誉分 100
可用分 4251
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-3
状态 离线
5

发表于 2015-3-10 22:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 newway 于 2015-3-10 22:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你的mix中没有酶的吗？如果没有可以加0,2ul试试。模板可以找一个你觉得比较好的温度（按上面的那个用56就可以）做一个梯度找出最适浓度啊，pcr体系中离子浓度高了也会影响的。 ...

mix里面没有酶，老师说换下taq酶，因为这次的taq酶是自制的，老师自己做ERV的PCR效果很好，但是我做就不行。。然后今天下午换了taq酶，然后把模板量改到了1微升，效果不错，唯一的就是温度梯度区分不大。。还要摸索。。谢谢了。。
顶部
阿拉蕾[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 69963
精华 0
积分 511
帖子 701
信誉分 100
可用分 4251
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-3
状态 离线
6

发表于 2015-3-10 22:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 jiushikeshui371 于 2015-3-10 22:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

建议引物pcr温度提高点，2度一个梯度，模板可以多加点，产物不多会不会是酶的问题，taq系列酶的话，应该会很亮的，pfu的话正常

嗯，确实是taq酶的问题，换了一个（因为之前的是老师自制的，老师自己用效果不错）模板量也要增加。谢谢了。。O(∩_∩)O
顶部
zhenxin[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76024
精华 0
积分 748
帖子 1216
信誉分 100
可用分 6848
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-31
状态 离线
7

发表于 2015-3-10 22:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个样子很正常 不错了 你的引物特异性挺好的，你可以尝试一下多加10个寻欢，亮度应该会提高挺多！
顶部
cbou876[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108885
精华 1
积分 376
帖子 347
信誉分 102
可用分 2604
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
8

发表于 2015-3-10 22:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

多加循环量应该就会多了。
顶部
jiushikeshui371[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108894
精华 1
积分 312
帖子 299
信誉分 102
可用分 2258
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
9

发表于 2015-3-10 22:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 阿拉蕾 于 2015-3-10 22:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

嗯，确实是taq酶的问题，换了一个（因为之前的是老师自制的，老师自己用效果不错）模板量也要增加。谢谢了。。O(∩_∩)O

呵呵，不客气，cuturl('http://bbs.bbioo.com/blog-140946-34185.html')这个有很多PCR的，可以看看
顶部
阿拉蕾[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 69963
精华 0
积分 511
帖子 701
信誉分 100
可用分 4251
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-3
状态 离线
10

发表于 2015-3-10 22:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 zhenxin 于 2015-3-10 22:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

这个样子很正常 不错了 你的引物特异性挺好的，你可以尝试一下多加10个寻欢，亮度应该会提高挺多！

是用来做SSCP的，只是产物比较少，我觉得35个循环已经很多了呀。。。
顶部
 19  1/2 12››