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标题:【求助】做大肠杆菌PCR过程中阴性对照有扩增

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发表于 2015-3-11 14:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】做大肠杆菌PCR过程中阴性对照有扩增

我pcr做的项目是大肠杆菌，分别采用了两对引物：引物对1uid和引物对2kscdc，同时采用荧光定量PCR和普通PCR。荧光定量PCR空白有扩增，CT值32以上，熔解曲线是单峰，基本都在80度左右，自己已非常注意污染问题，但是空白扩增问题无法解决。采用普通PCR电泳后，发现污染并非目标片段扩增，具体见下图，请各位帮忙分析一下到底是由于什么原因导致阴性对照有扩增？不胜感谢！
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发表于 2015-3-11 14:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我pcr做的项目是大肠杆菌，分别采用了两对引物：引物对1uid和引物对2kscdc，同时采用荧光定量PCR和普通PCR。荧光定量PCR空白有扩增，CT值32以上，熔解曲线是单峰，基本都在80度左右，自己已非常注意污染问题，但是空白扩增问题无法解决。采用普通PCR电泳后，发现污染并非目标片段扩增，具体见下图，请各位帮忙分析一下到底是由于什么原因导致阴性对照有扩增？不胜感谢！
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发表于 2015-3-11 14:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
电泳图左边第二条是大肠杆菌阳性对照，其它都是阴性对照。
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chengjie79[使用道具]
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发表于 2015-3-11 14:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的电泳图我没太看明白，你的目的条带多大，杂带多大？还有，截一张你的目的片段和空白对照在一起的溶解曲线和扩增曲线我看下。

冒昧的问下，你们的qPCR一起是ABI 的7500还是plnsone？你们的凝胶成像系统是最新的QIAGEN 的一款不用制凝胶，加样后直接就能出图的嘛？
谢谢
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发表于 2015-3-11 14:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 chengjie79 于 2015-3-11 14:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你的电泳图我没太看明白，你的目的条带多大，杂带多大？还有，截一张你的目的片段和空白对照在一起的溶解曲线和扩增曲线我看下。

冒昧的问下，你们的qPCR一起是ABI 的7500还是plnsone？你们的凝胶成像系统是最新的QIAGEN 的一 ...

目的条带100左右，阳性标本位置是正确的，杂带有很多条，但都不是在目的片段附近，空白大概出现在50、260、500Bp左右，杂菌出现的条带也很多，不过也不在目的片段附近，基本上都很淡，我的实验中设计了两对引物，情况基本相同。
“截一张你的目的片段和空白对照在一起的溶解曲线和扩增曲线我看下。”溶解曲线目的片段和空白对照都是单峰，位置相差最多1-2度，我下次再截图，目的片段和空白对照扩增曲线都是很光滑，如图，只是CT值不同而已。
我们的qPCR一起是ABI 的7500，凝胶成像系统是QIAGEN 的一款不用制凝胶QIAXceL，加样后直接就能出图的。
过两天我就要用探针法检测了，我们保持联络。谢谢！
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发表于 2015-3-11 14:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的引物设计的可能不太好，有非特异性扩增。空白有可能是污染，不是说你加样过程中的问题，而是你加样所处的环境。因为你做的是细菌的，你们可能经常在那做PCR扩增，导致空气中有很多DNA片段的气溶胶而污染你的空白。
还有，我好奇你阳性也有好几条杂带，是否也出现好几条溶解曲线？这样你的实验结果就不好啦！
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发表于 2015-3-11 14:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 yonger 于 2015-3-11 14:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你的引物设计的可能不太好，有非特异性扩增。空白有可能是污染，不是说你加样过程中的问题，而是你加样所处的环境。因为你做的是细菌的，你们可能经常在那做PCR扩增，导致空气中有很多DNA片段的气溶胶而污染你的空白。
还有，我 ...

两对引物都是别人设计的，不过我上NCBI BLAST,特异性还可以，出来的结果除个别外都是大肠杆菌。
我觉得出来的杂带应该是非特异性扩增，如果是污染应该有目的条带。但是有个问题，非特异性扩增的杂带怎么会那么大BP.
气溶胶污染，我基本上可以排除，因为我已开了生物安全柜的风机，测了尘埃粒子，空气非常洁净。我怀疑是预混液中含有大肠杆菌的DNA片段，但如果是这样的话，目的条带怎么又没有呢？
阳性也有好几条杂带，只是出现好1个溶解峰，因为荧光定量法的预混液用的是ABI SYBGREEN和普通PCR的预混液是天根公司。所以可比性差了点。
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memory[使用道具]
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发表于 2015-3-11 14:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用特异性好点的MIX扩增下，也可以直接拿定量的产物跑下电泳就知道啦！         
你们是哪个学校还是？
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 小中大
杂带的问题，通过更换PCR预混液后，已得到解决，谢谢各位关注
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ALALA[使用道具]
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发表于 2015-3-11 14:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问你换的什么预混液啊？哪个公司的？
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