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标题:【求助】AFLP产物银染条带很淡

ero11[使用道具]
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你的染色方法是什么呢?具体的步骤
我原来也经常出现你这种现象
建议你把PAGE配制用的东西都换一遍
另外:缓冲液一定要是新的
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bongte[使用道具]
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实验问题出在:银染或显色步骤!你认真把你的试剂核查一下,特别注意甲醛的浓度(甲醛本身的质量分数就是36%,你别按100%去稀释成36%,结果就是显色很浅),另外显色液要预冷,显色时间一定卡死!
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gemei0115[使用道具]
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我跟你一样是跑这种变性胶的(不过不是AFLP,是SSR,实验室其他人有在做),跑了快两年了。
从你marker的条带看,你的染色和显影没有问题,问题应该出在PCR上,但是具体是哪一步我太清楚。(我没做过AFLP,我可以帮你问下实验室其他做AFLP的人,问了再回复你)。
另外,感觉你跑电泳的时候功率是不是太大了,你所有看得清的条带都很弯,这样不好读带。
“我看网上很多说银染好坏跟温度有关,我实验室没有空调,都是室温银染的,不知道有没有影响!)”银染跟温度有关吗?从没听说过。有没有空调都一样吧,我们都是室温染色,然后室温显影。(冬天夏天一样,我在广州)如果想要显影的时候快点,可以把显影液65度水浴,水浴后会快很多。
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nvdabing[使用道具]
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让我想起6年前的实验。 请问你的显影液放在冰水里预冷了没有?甲醛,硝酸银,显影液都要十分的纯净,我当时 ...

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双蒸水和显影液都是在4度冰箱预冷的!
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nvdabing[使用道具]
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你的染色方法是什么呢?具体的步骤
我原来也经常出现你这种现象
建议你把PAGE配制用的东西都换一遍

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我采用了2种显色方法,得到的结果都一样。以下两种显色方法都试了!

l     固定:10 %冰醋酸,摇动30分钟至凝胶全部脱色。双蒸水冲洗2-3次,每次5 min。

l     染色:1 %硝酸银,1.5 ml甲醛(37 %),摇动20 min。冲洗5 s(快速移入显色剂中)。

l     显色:(1)30 g/L碳酸钠,显影前加入1.5 ml甲醛和(10 g/L硫代硫酸钠200 ul),轻轻摇动至显影。
                (2)5g/L氢氧化钠,显影前加入1.5 ml甲醛和(10 g/L硫代硫酸钠200 ul),轻轻摇动至显影。

l     定影:10 %冰醋酸,轻轻摇动5 min。冲洗2-3次,室温晾干。
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nvdabing[使用道具]
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实验问题出在:银染或显色步骤!你认真把你的试剂核查一下,特别注意甲醛的浓度(甲醛本身的质量分数就是36 ...

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如果是银染问题,为什么marker跑的条带很清晰,就是AFLP产物不行?是不是我预扩增产物稀释倍数少了,导致背景过深,非特异条带较多?(我预扩产物只稀释了10倍!)
我采用了2种显色方法,得到的结果都一样。以下两种显色方法都试了!


l     固定:10 %冰醋酸,摇动30分钟至凝胶全部脱色。双蒸水冲洗2-3次,每次5 min。

l     染色:1 %硝酸银,1.5 ml甲醛(37 %),摇动20 min。冲洗5 s(快速移入显色剂中)。

l     显色:(1)30 g/L碳酸钠,显影前加入1.5 ml甲醛和(10 g/L硫代硫酸钠200 ul),轻轻摇动至显影。
         (2)5g/L氢氧化钠,显影前加入1.5 ml甲醛和(10 g/L硫代硫酸钠200 ul),轻轻摇动至显影。

l     定影:10 %冰醋酸,轻轻摇动5 min。冲洗2-3次,室温晾干。
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我跟你一样是跑这种变性胶的(不过不是AFLP,是SSR,实验室其他人有在做),跑了快两年了。
从你marker的条 ...

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是不是我AFLP的预扩产物稀释太少了(10倍)?我试了几十种引物组合,结果还是这样?是不是预扩稀释倍数太少导致选扩结果非特异条带较多,背景色较深?有个老师建议我把预扩产物稀释100-500倍试下?你觉得稀释这么多还有预扩产物吗?急急急...............
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vcve[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 nvdabing 于 2015-3-11 15:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我跟你一样是跑这种变性胶的(不过不是AFLP,是SSR,实验室其他人有在做),跑了快两年了。
从你marker的条 ...

======================================================================================================= ...

我现在没办法回复你,现在周末实验室做AFLP的人一个都不在。
既然你觉得是稀释倍数的原因,你可以自己试下嘛。看看结果怎样。。。


另外你染色显影的过程太麻烦了,我们只有染色和显影,没有固定和定影这两步。
染色液:10%无水乙醇,0.5%冰醋酸,2g硝酸银
显影液:30g氢氧化钠,1ml 甲醛定容至1L。

染色至少10分钟,染完冲洗下(主要是把表面的银离子洗掉),再显影,直至出现条带。。
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vcve[使用道具]
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你觉得稀释这么多还有预扩产物吗?

预扩增的产物浓度应该很高吧,你可以用分光光度计检测下浓度。PCR模板浓度太高对扩增是有影响的,我做SSR10微升μL体系里只有20ng的模板。
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nvdabing[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 vcve 于 2015-3-11 15:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你觉得稀释这么多还有预扩产物吗?

预扩增的产物浓度应该很高吧,你可以用分光光度计检测下浓度。PCR模板浓度太高对扩增是有影响的,我做SSR10微升μL体系里只有20ng的模板。 ...

大家帮我分析下这张选扩电泳图:1122334455采用的引物组合是E-ACA/M-CTA,AABBCCDDEE采用的引物组合是E-ACT/M-CAT。
12345/ABCDE分别是10、30、50、100、500倍的预扩产物稀释倍数,采用的为同一组预扩产物进行选扩。
大家看看这张电泳图是不是觉得预扩产物10倍稀释(11、AA)的选扩结果背景很亮?我是不是该选着500倍稀释(EE)呢?


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