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标题:【求助】请大家帮忙看看怎样来优化pcr体系

牛顿[使用道具]
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发表于 2015-3-11 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请大家帮忙看看怎样来优化pcr体系

最近要做DNA回收~一直在做体系的优化~想减少一些杂带和引物二聚体~
这是今天我做的pcr电泳图
大致信息如下：
mark：D2000
3种引物都是简并引物
DNA模板相同
退火温度是筛选过的
体系都是：50ul
MIX：25ul
primer1：2.5ul
primer2:  2.5ul
ddH2O:  17.5ul
teaplate:  2.5ul

上左图：PCR扩怎程序大致为：
94℃——5min
·························
94℃——40s
60℃——40s            ×35循环
72℃——1.5min
··························
72℃——10min

上右图：PCR扩怎程序大致为：
94℃——5min
·························
94℃——40s
55℃——40s            ×35循环
72℃——1.5min
··························
72℃——5min

下图：PCR扩怎程序大致为：
94℃——5min
·························
94℃——40s
60℃——40s            ×35循环
72℃——1.5min
··························
72℃——10min

之前做过10ul体系 效果还可以 杂带和引物二聚体都很少
体系：5ul
MIX：0.5ul
primer1：0.5ul
primer2:  0.5ul
ddH2O:   3.5ul
teaplate:  0.5ul

要回收DNA~所以我把体系加到50ul~其实就是将10ul体系乘以5 结果 出现了很多杂带和引物二聚体 我要怎么调整 体系或者是pcr过程来减少杂带和引物二聚体 而使我要的DNA片段比较亮？请各位高手指点一下！O(∩_∩)O谢谢


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2015-3-11 16:23
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one[使用道具]
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发表于 2015-3-11 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有没有试过加BSA或者提高退火温度
或者进行2次PCR，得到的条带应该会比较纯
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发表于 2015-3-11 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
或者是加一点DMSO，非特异的带就少很多》
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发表于 2015-3-11 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

体系虽然加倍，但并不是所有的试剂加倍就行，引物没必要加倍，不然二聚体现象会严重。模版浓度是多少？
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发表于 2015-3-11 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
减少引物和模板量，提高退火温度，要是用Taq酶在退火温度为52以上时加入1.35微升每十微升体系会更好  KOD酶就不用加了   一般胶回收的话用KOD做比较好  保真性高
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yapuyapu[使用道具]
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发表于 2015-3-11 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
直接切胶回收就可以呀，杂带没有影响的
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jingling845[使用道具]
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发表于 2015-3-11 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

降低体系中的Mg离子浓度
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土壤[使用道具]
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发表于 2015-3-11 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
学习学习！
来个巢式PCR吧！
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TAT[使用道具]
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发表于 2015-3-11 16:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用spss做个多因素的正交设计，全面优化条件
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daod[使用道具]
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发表于 2015-3-11 16:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
适当的减少引物的浓度，稍微提高退火温度试试
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