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标题:【求助】SYBR实时荧光定量PCR结果分析

ukonptp[使用道具]
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发表于 2015-3-11 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】SYBR实时荧光定量PCR结果分析

以下两图为建立标准曲线时跑出来的扩增曲线和溶解曲线，每个图到第五个浓度就开始出现异常，以后就一直和浓度五的曲线重叠，请问是什么原因？有没有可能是pcr产物浓度的原因？如果是怎样解决，谢谢帮助~~
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mod=8048[使用道具]
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发表于 2015-3-11 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

貌似要做绝对定量的  标准曲线？
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2015-3-11 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 mod=8048 于 2015-3-11 17:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

貌似要做绝对定量的  标准曲线？

我做的是相对定量的，所以只需要做一次标准曲线~
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发表于 2015-3-11 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人觉得是浓度问题 我也碰到过类似情况，就是说你用的引物浓度已经无法使第四个浓度和后面的浓度梯度之间产生差异，可能是DNA浓度太低或者你稀释后面低浓度梯度没有稀释好
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发表于 2015-3-11 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
后面的模版浓度太低导致的！
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2015-3-11 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

后面的模版浓度太低导致的！
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2015-3-11 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 3648755 于 2015-3-11 17:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

个人觉得是浓度问题 我也碰到过类似情况，就是说你用的引物浓度已经无法使第四个浓度和后面的浓度梯度之间产生差异，可能是DNA浓度太低或者你稀释后面低浓度梯度没有稀释好 ...

谢谢你的帮助，我想请问，如果是DNA浓度太低，有什么方法可以解决？
PS：因为组织样品的量很少，所以提取的总RNA量很少。
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发表于 2015-3-11 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 ritou1985 于 2015-3-11 17:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

后面的模版浓度太低导致的！

谢谢你的帮助，我想请问，如果是DNA浓度太低，有什么方法可以解决？
PS：因为组织样品的量很少，所以提取的总RNA量很少。
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发表于 2015-3-11 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 ukonptp 于 2015-3-11 17:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢你的帮助，我想请问，如果是DNA浓度太低，有什么方法可以解决？
PS：因为组织样品的量很少，所以提取的总RNA量很少。

你可以反转过来，之后用你的引物以cDNA为模版扩增，然后胶回收，用胶回收产物做标准曲线。
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2015-3-11 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 HP007 于 2015-3-11 17:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你可以反转过来，之后用你的引物以cDNA为模版扩增，然后胶回收，用胶回收产物做标准曲线。

我已经使用的是胶回收产物跑的标准曲线，电泳跑出来的目的条带很亮，如果回收时最后一步加入的溶解液少一些，会不会使浓度达标呢？谢谢你~~
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