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标题:【求助】请大家帮我分析一下qPCR程序应该怎么优化？

lyxsqs[使用道具]
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发表于 2015-3-11 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请大家帮我分析一下qPCR程序应该怎么优化？

小弟最近刚刚接触qpcr很多地方不懂想向大家请教一下，昨天刚做的qPCR出现了引物2聚体和双峰现象，请大家帮忙分析一下。qPCR是用ABI7500，一下程序做的：95℃ 10min，95℃ 15S，55℃ 30S，72℃ 40S ，40个循环做的。我的普通PCR用30个条带跑的很好是单一条带，除了循环数程序都一样，PCR体系也是一样的。我的DNA是从土壤中提取的，引物是专门扩增pmoA基因的引物。请大家帮忙分析一下，在线等。


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2015-3-11 17:31
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8princess8[使用道具]
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发表于 2015-3-11 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知道  貌似我还没出现这个情况
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lyxsqs[使用道具]
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发表于 2015-3-11 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 8princess8 于 2015-3-11 17:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
不知道  貌似我还没出现这个情况

我都做了好久了，优化了很多次，只有30个循环结果好点
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redbutterfly[使用道具]
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发表于 2015-3-11 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

琼脂糖的分辨力很低，可以提高退火温度尝试
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lyxsqs[使用道具]
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发表于 2015-3-11 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 redbutterfly 于 2015-3-11 17:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

琼脂糖的分辨力很低，可以提高退火温度尝试

提高了不管用！我从55度一直上升到65度，55度P的最亮！
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发表于 2015-3-11 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

把退火温度提高一些，太低会影响的。
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发表于 2015-3-11 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以换引物试试吧，多态性扩增，扩增的片段和目的片段大小差不多，所以跑胶分辨不出来！
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caihong[使用道具]
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发表于 2015-3-11 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
循环数偏多了，最好35cycles以下，峰太多，底物不单一，引物特异性差
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caihong[使用道具]
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发表于 2015-3-11 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 lyxsqs 于 2015-3-11 17:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

提高了不管用！我从55度一直上升到65度，55度P的最亮！

最亮也并不一定代表那就是最好的扩增模式，只能说明体系采用这个退火温度，扩增效率最高，但它的特异性并不能保证，咱们是做荧光定量，并不是需要产生多好的目的基因产物，只要没有非特异性扩增，CT值合理就行了。假如那第二个峰代表的是二聚体的话，那就适当降低引物溶度，要是它代表非特异性产物的话，只能提高退火温度进行尝试，可以直接进行qPCR尝试。
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lyxsqs[使用道具]
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发表于 2015-3-11 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 caihong 于 2015-3-11 17:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

最亮也并不一定代表那就是最好的扩增模式，只能说明体系采用这个退火温度，扩增效率最高，但它的特异性并不能保证，咱们是做荧光定量，并不是需要产生多好的目的基因产物，只要没有非特异性扩增，CT值合理就行了。假如那第二个峰 ...

嗯！我做了普通的PCR温度梯度，效果都不是很明显！我打算先降低引物浓度先，看看情况！然后再做个温度梯度看看！
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