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标题:【求助】SYBR Green 实时荧光PCR

蓝蜗牛[使用道具]
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发表于 2015-3-11 17:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】SYBR Green 实时荧光PCR

起得最早的是我的阳性样品，其次的是检测样品需要说明的是检测样品和我的阳性样品不是同一物种，而我要建立的是阳性这一样品的快速检测系统，我想问一下出现现在这种情况是不是证明引物不特异还是别的问题？CT值在30，31那个位置的是阴性对照，阴性对照也出来了是怎么回事？各位大侠帮忙解决一下！谢谢了！


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tewank[使用道具]
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发表于 2015-3-11 17:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这对引物的特异性还行，但是既然阴性也能扩增，我怀疑你这个扩增产物可能是污染的基因组为模板扩增出来的
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发表于 2015-3-11 17:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这位大侠你好！谢谢你！我想请教一下您，我的空白老是在ct值25-26之后的地方出来，我已经排除过污染了所有的都用的是新的，还是出来不知道怎么回事？帮帮我呗
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ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2015-3-11 17:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
荧光信号的灵敏度非常强，阴性对照完全没有信号也不现实，但是如果空白的Ct都在25左右，拿这对引物很可能是有问题的
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发表于 2015-3-11 17:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 ladyhuahua 于 2015-3-11 17:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
荧光信号的灵敏度非常强，阴性对照完全没有信号也不现实，但是如果空白的Ct都在25左右，拿这对引物很可能是有问题的

我想请教一下您觉得是引物的问题还是污染问题？还是引物量太大？10um的引物我各加了0.5ul
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vera+[使用道具]
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发表于 2015-3-11 17:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

引物还行，一般阴性对照时Ct值大于30就可以了，如果小于30的话只能说是引物设计的不好（排除污染可能）。
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发表于 2015-3-11 17:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想请教一下出现这样的问题是什么原因造成的？
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发表于 2015-3-11 17:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用的新的也不一定不出现阴性起线，实验室污染也有可能，排除污染可以用dUTP/UNG酶法试试。
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蓝蜗牛[使用道具]
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发表于 2015-3-11 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好！我想请教一下什么是dUTP/UNG酶法呀？我刚开始做这方面的实验，麻烦指教一下，谢谢了
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ffaa[使用道具]
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发表于 2015-3-11 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
阴性出现扩增，有可能是引物自身的二聚化等引起的，可能扩增到的不是目的基因，所以你跑完Real time后，把反应液跑个胶看看，是否是目的产物扩增，虽然你的融解曲线中，阴性的融解温度和目的产物的一致，但是引物的二聚化和正常的序列不一样，所以有可能出现相同的融解温度。这样就可以排除是污染还是引物特异性不好
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