【转帖】【分享帖】制药技术精华帖汇总（二） - 经验共享

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标题:【转帖】【分享帖】制药技术精华帖汇总（二）

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小中大

冻干设备应改进的问题解析

冻干设备激发我国农产品加工发展潜力长期以来，我国的农牧产品一直徘徊在出口原料或初级加工阶段，给人一种技术含量低的总体感觉。通过开发冻干蔬菜和肉食等，将提高我国出口食品的档次，获得较高的附加值。
　　干燥是保持物质不致腐败变质的方法之一。干燥的方法许多，如晒干、煮干、烘干、喷雾干燥和真空干燥等。但这些干燥方法都是在0℃以上或更高的温度下进行。干燥所得的产品，一般是体积缩小、质地变硬，有些物质发生了氧化，一些易挥发的成分大部分会损失掉，有些热敏性的物质，如蛋白质、维生素会发生变性。微生物会失去生物活力，干燥后的物质不易在水中溶解等。因此干燥后的产品与干燥前相比在性状上有很大的差别。
　　而冷冻干燥法不同于以上的干燥方法，产品的干燥基本上在0℃以下的温度进行，即在产品冻结的状态下进行，直到后期，为了进一步降低产品的残余水份含量，才让产品升至0℃以上的温度，但一般不超过40℃。冷冻干燥就是把含有大量水分物质，预先进行降温冻结成固体，然后在真空的条件下使水蒸汽直接升华出来，而物质本身剩留在冻结时的冰架中，因此它干燥后体积不变，疏松多孔在升华时要吸收热量。引起产品本身温度的下降而减慢升华速度，为了增加升华速度，缩短干燥时间，必须要对产品进行适当加热。整个干燥是在较低的温度下进行的。大力发展冻干食品，把丰富的农副产品深加工增值、外销、创汇。加工冻干食品，规模越大生产成本越低，效益越高。如每年各以100天加工大蒜片、胡萝卜丁、小葱估3个产品，则60平方米生产线的年产值为500万元：450平方米生产线，年产值为3500万元，一般年利率在30%以上。如开发冻干面积1200平方米生产线，可加工鲜菜万吨左右，可加工2000多吨冻菜，年产值可达1亿多元，年利税可达4000万元-5000万元。
　　我国冻干设备应改进的问题一、降低成本、减少能耗：国外一些冻干机不采用不锈钢制造，而采用低碳钢涂覆食品用可烘干树脂，在室温下会发出红外线。搁板表面涂高性能远红外发射材料、增强其辐射能力;料盘表面处理，增强其吸收能力。捕水器的结构、尺寸及结霜特性的优化更有实际意义，因为目前其造价相当于冻干箱的造价，运转功耗较大。对于冻干机而言，加热系统只是补充升华热，功率消耗本不应太高，但现有设备不尽如人意，应加以优化结构，并降低能耗。二、开发连续式冻干设备：当前生产的冻干机大都是间歇式产品，随着工业技术大量的发展，开发连续式冻干设备，增加冻干产品的产量将是必然趋势。三、保证质量提高性能在实际应用中：一些厂家的冻干机安装后，一直不能投入正常的生产;有些冻干机虽然能生产，但能耗高。还有一些元器件不断出现故障、影响正常生产。因此，必须保证冻干机的质量。提高性能是指除加热速率、抽气速率、温度均匀性、真空度稳定性之外，增强设备新的功能。
　　发展中国的冻干食品产业，就必须开发中国的食品冻干设备。针对目前冻干设备存在的问题，军事医学科学院卫生学环境医学研究所、实验仪器厂和北京四环科学仪器厂共同完成了“智能型冷冻干燥机系列产品的研制与应用”研究，研制成功高效、绿色、环保的单机混合制冷系统，研发出的多功能监控软件实现了对冻干数据的远程实时采集、跟踪和对冻干进程的实时监控。因此可以说，我国干燥设备行业已经开始进入较成熟的阶段，能够比较好地满足各个领域用户的实际需要，专业干燥设备厂非常多，其产品既有通用性，也各有特点，这就为用于原料药干燥的进口设备国产化和选择符合新版GMP的理想干燥器提供了条件。鉴于真空干燥设备绿色优点，应用日益广泛。在食品、药品干燥方面，对较大规格的真空干燥设备需求量将逐步增加，市场前景非常巨大。

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小中大

冻干技术在基因工程药物中的应用

1  冷冻干燥技术的原理和应用
（1）  原  理
冷冻干燥是指将药品在低温下冻结,然后在真空条件下升华干燥,去除冰晶,待升华结束后再进行解吸干燥,除去部分结合水的干燥方法该过程主要可分为药品准备!预冻!一次干燥(升华干燥)!二次干燥(解吸干燥)!密封保存等步骤图1所示纵坐标为气压,横坐标为温度,0℃(实际为0.001℃)为三相点,表示水以液体存在时的最低大气压,低于该点气压,水只能以冰或蒸气存在,也就是在此时升温时,水只能从冰直接变成蒸气,冷冻干燥就是远低于该气压(高真空度)下干燥水分的,通常在66~133Pa真空度和-25℃以下,才能保证冷冻干燥顺利进行。
（2）  优点与缺点
冷冻干燥与其他干燥方法相比,有以下优点:
1)药液在冻干前分装,分装方便!准确!可实现连续化;
2)处理条件温和,在低温低压下干燥,有利于热敏物质保持活性,可避免高温高压下的分解变性,以实现蛋白质不会变性;
3)含水量低,冻干产品含水量一般在1%~3%,同时在真空,甚至可在通N2保护情况下干燥和保存,产品不易被氧化,有利于长途运输和长期保存;
4)产品外观优良,为多孔疏松结构且颜色基本不变,复水性好,冻干药品能迅速吸水还原成冻干前状态;
5)冻干设备封闭操作,安装环境洁净度高,减少杂菌和微粒的污染,干燥中和封装后的缺氧可起到灭菌和抑制某些细菌活力的作用
冷冻干燥及制品的缺点和不足:
1)设备要求高!投资大!干燥速率低!干燥时间长!能耗高;
2)生物活性物质(如多肽和蛋白质药物)采用冻干制剂主要是为了保持活性,但配料(如保护剂!溶剂!缓冲剂等)选择不合理!工艺操作不合理!冻干设备选择不适当都可能在冻干制剂制备过程中失活,导致产品前功尽弃,这是生产冻干制剂的关键,需进行基础研究和针对特定产品反复试验;
3)溶剂不能随意选择,只限于水或一些冰点较高的有机溶剂,所以很难制备某种特殊的晶型,有时冻干品在复水溶解时会出现浑浊现象,这些均为开发冻干制剂所必须考虑和实验研究的。
（3）  冷冻干燥技术的应用
冷冻干燥技术于1813年英国人Wallaston发明,1909年Shsckell试验用该方法对抗毒素!菌种!狂犬病毒及其他生物制品进行冻干保存,取得了较好的效果在第二次世界大战中由于对血液制品的大量需求,冷冻干燥技术得到了迅速发展,进入了工业应用阶段。50年代冻干食品系统的大规模发展,促进了冻干技术和设备的进步,但由于高难度!高投入!高能耗和制造设备的落后,经历了几十年的起伏和徘徊。近20多年来,随着人们生活水平提高,对食品的品质!营养!天然无公害的观念转变,推动了冻干技术的发展,生产过程从间歇式到连续式,设备从0.1m2到上千m2形成系列,应用范围广泛:在科研方面,应用于如分析土壤中的衡量成分;去除高效液相色谱收集组分的溶剂;考古中发现的重要文物如布匹!皮革!竹简等的干燥脱水等在工业上,应用于冻干食品如蔬菜!水果!海产品!甚至鲜花等;香料及调味品如咖啡!茶及各种香料!调味料;保存营养保健成分及色香味形的方便食品(日本方便食品中50%是冻干食品);水产品最广泛!要求最严格的还是在医药和生物制品方面的应用,主要是应用于血清!菌种!基因工程药物!疫苗!天然药物及生物制品等我国生物制品规程2000版中,确定的11个重组治疗蛋白药物就有8个是冻干制剂,如重组人干扰素α1b!重组人干扰素α2b!重组人干扰素α2b!重组人干扰素γ!重组人白介素22!重组人红细胞生成素!重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子!重组链激酶。
冷干制剂的生产过程
基因工程多肽和蛋白质药物冻干制剂是通过宿主体(微生物或动物细胞)培养获得表达产品!经分离纯化得到活性物质,经过配制!过滤与分装,分装好的样品送入冷冻干燥机,进行预冻!升华!干燥,最后封口因此冻干制剂的生产过程包括药物准备!预冻!一次干燥(升华干燥)和二次干燥(解吸干燥)!密封保存等5个步骤。以下将详细说明。
对于新产品的开发,则必须通过实验来确定冻干的工艺条件,在药物准备好后,要确定药物水溶液的共熔点,共熔点对冷冻干燥很重要,因为药液是一个复杂的液体,当温度下降到某一温度时晶体开始析出,随温度下降,晶体数量增加,到最后才全部凝结,此时温度叫共凝点,若从冷冻状态升温到共凝点,融化开始,这就溶质和溶剂的共熔点。不同物质的共熔点不同,如0.85%氯化钠溶液为-21.2℃,而10%葡萄糖溶液为-27℃共熔点的测量有热分析法!电阻法和低温显微镜直接观察等方法。热分析法是基于冻结的药品在升温过程中,温度达到共熔点时会突然有个能量的吸收,用热分析仪来测定该能量吸收峰可计算得到共熔点温度;电阻法是在降温冷冻或先冷冻后升温过程中电阻突然变大或变小求得,对非离子型有机化合物其电阻变化不明显,可加入一定量的附加剂来测定冷冻干燥是在真空状态下进行,只有药液全部冻结后才能在真空下升华,否则部分液体存在时,在真空下不仅会迅速蒸发,造成液体的浓缩,使冻干产品萎缩,而且溶解在水中的气体在真空下会迅速冒出来,造成液体沸腾,甚至冒出冻干瓶外,所以冻干产品在开始升华时的温度必须低于共熔点,全部冻结。
冷冻干燥时间一般较长,为保证产品质量和缩短生产周期,必需通过反复试验来确定冻干曲线,因为冻干效果是以冻干制剂与原药液的活性保存率来衡量,而活性保存率既与冻干曲线有关,亦与药液的组成与配比有关,因此需多次反复试验才能进行优化与确定。

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小中大

冻干制剂经验谈

一、冻干制剂并不难
冻干机体积硕大，动辄充栋盈屋。庞然如斯，总不免让人产生难以驾驭的错觉。其实，从冻干机理来看，冻干机无非就是一种两台大冰箱加一个真空泵的结构。其中一个冰箱首先负责把药品冻成冰块，然后开动真空泵营造一种低真空的环境。在此减压环境下，物体的沸点、熔点等热常数都相应降低，因而，箱内的药品轻微受热后即能在低温条件下从固体升华为气体。这些气体随即流向另外一个大冰箱，被捕捉下来重新凝结成冰块。当药品的水分完全抽干以后，便完成了一个冻干过程。
冻干操作中最为关键的环节当数对制品共熔点（或共晶点）温度的把握。如果能够在制品温度上升到共熔点之前把大部分的水分抽去，那么成功也就为期不远了。所谓共熔点，就是溶液全部凝结的温度。
常用的共晶点测量仪器主要是基于相变过程中电阻率突变的原理来制作的。但不少品种对共熔点（或共晶点）温度的要求并不需要过于精确，一般来说，我们可以在预冻阶段通过视窗来观察制品性状的变化来获得。当制品开始结冰的时候，浸入制品中的电热偶所探测到的温度会突然回升，这是因为结冰过程的放热现象所造成的。这时候，我们录得的温度就大致接近于共熔点（或共晶点）温度。
在共熔点（或共晶点）之前抽去90%以上的水分的过程在专业术语上称为一次干燥期。判断一次干燥结束的时间也是比较重要的。过早或过晚判断，都会造成冻感、干品质的降低或能量和时间的消耗。
最直观的方法，是根据制品的形状来判断。一次干燥后期，大部分水分被抽去。就好象随着洪水退去，墙面的水线不断下降一样，我们可以观测到制品上面也有一条水线不断下降，直至消失。水线消失，也就意味着一次干燥即将结束了。第二种方法，可以根据箱内压力的变化趋势来加以判断，当大部分被抽去以后，箱内的压力将不断下降，直至呈现线形。第三种方法，可以根据制品温度的变化来判断。当大部分被抽去以后，我们会发现，制品的温度与搁板的温度会越来越接近。
为了缩短干燥时间，除了可在预冻阶段的晶形做文章以外，还可以在升华阶段适当地掺入气体，使真空值在一定范围内波动（一般不宜超过30Pa）。这种办法使热传递方式不再是靠热传导来主打，还增强了热对流的方式，加快了水分解析的速度，每每奏效。
二、预冻速率
我服膺于这样一种说法，即，预冻过程在很大程度上决定了干燥过程的快慢和冻干产品的质量。
通常介绍冻干理论的书籍都会提到，降温速率越大，溶液的过冷度和过饱和度愈大，临界结晶的粒度则愈小，成核速度越快，容易形成颗粒较多尺寸较小的细晶。因而冰晶升华后，物料内形成的孔隙尺寸较小，干燥速率低，但干后复水性好；相反，慢速冻结容易形成大颗粒的冰晶,冰晶升华后形成的水气逸出通道尺寸较大，有利于提高干燥速率，但干后复水性差。
这样说当然没有错，可是不要忘记，这种理论是在受热均匀的前提下得出来的，然而我们厂里的医药冻干机所提供的冻干条件却没有这么理想，所谓快冻慢冻，可不是导热油降温快慢一句话可以了得的。相对而言，我还是比较赞成医药网络论坛丁香园战友tinybayonet的提法。他把快冻慢冻分为以下几类：1、板温降得较快，且板温比品温低很多，则制品底部先冻结产生结晶，但上部液体仍较热，所以不至于瞬间全部结晶，结晶会缓慢生长，就得到了慢冻的效果。2、板温降得较慢，板温与品温相差不大，则制品整体均匀降温，并形成过冷，当能量积累足够时，瞬间全部结晶，得到了快冻的效果。3、板温降得很慢，并在低于共熔点的适宜温度保持（或缓慢降温），则制品形成较小的过冷度，液体中先出现少量结晶，继续降温结晶生长，得到大结晶，这即是真正的慢冻。4、制品浸入超低温环境（如液氮），整体瞬间结晶，形成极细小的晶体（或处于无定形态），这即是真正的快冻。对于tinybayonet提到的这几种现象，我都在试验过程中发现过，因此，我还是比较赞成这种划分方法的。
更何况，企业大多数情况下还是采用瓶冻的冻干方法的，瓶冻的受热不均匀现象就更明显了。根据对瓶装制品搁板预冻过程的研究，样品初温越高，样料液上下部分的温度梯度越大，冰晶生长速度越慢。溶液若慢速降温，则形成冰晶比较粗大，冰界面由下向上推进的速度慢，溶液中溶质迁移时间充足，溶液表面冻结层溶质积聚也就多。因而导致上表层的溶质往往较多，密度较高，而下底层密度较小，结构疏松。同时，在不同的预冻温度下冻结的样品，干燥后支架孔径人小有明显差异。预冻温度愈低，支架孔隙直径愈小。这种分层现象，在骨架差的制品上体现得最为明显，或者底部萎缩，或者中间断层，或者顶部突起，或者顶部脱落一层硬壳，不一而足。
为了瓶冻分层的现象，在实践中，有人提倡使用三步法，即将样品从室温先冷却至样品的初始冻结温度；停止降温过程，使样品内温度自动平衡，消除其内的温度梯度；然后再迅速降温，由于此时样品整体温度离结晶温度较近，且样品在冻结过程中，样品温度下降较慢，故样品在冻结过程中温度梯度会相对较小，冰晶生长速度必相对较快。如此，便提高了预冻速率，解决了溶质聚集在上层的问题。不过，并不是所有的品种使用了三步法后都能取得明显效果的。
三、溶媒结晶品和冻干品的优劣
商务部有位同事曾经问我，溶媒结晶品和冻干品，孰优孰劣？我当时都不知道如何回答。在我看来，很难一言以蔽之。
理论上，冻干品中的活性成分以结晶态或无定形态（非晶态）的形式存在。一般对于抗生素来讲，以晶态存在时，具有更高的稳定性。在储存过程中，无定形态总有向晶态转变的趋势。因此，我只能说在许多情况下溶媒结晶的抗生素类稳定性可能要好一些。不过，这种差别有时候不是特别大，而且溶媒结晶品的价格可能数倍冻干品，两相权衡，有些人还是会选择冻干品的。
只是，我有一点困惑。理论上，晶态结构的溶解性要比无定形态差，可是有人研究发现，对于某些抗生素药物，溶媒结晶品的溶解性优于冻干品。关于这种现象，我一时间找不到理论支持，甚为困惑。
至于生物类制品就不一定欢迎结晶态了，因为冻结过程中冰晶的生长会对组织和结构造成损坏。顺便提一下，非晶态材料主要有金属、无机物和有机物三类。玻璃态原来专指硅酸盐类的无定形态，可是后来泛而用之，所有的无定形态（非晶态）也称为玻璃态了。
四、关于澄清度和可见异物
有位第四军医大的网友包老师，很喜欢跟人切磋冻干问题。他认为，浑浊、乳光或可见异物的出现与不溶性微粒的大小有关。小于10nm的微粒才是清澈透明的；当微粒大于100nm时，微粒出现在溶液中,可以引起浑浊；在10-100nm范围内，产生光散射，就可以观察到乳光、浑浊；微粒再大一些，就有沉淀和结晶析出了，这就是μm级的了。
我不知道他这种说法出处在哪，可是根据我自己的体会，我是赞成的。
至于形成微粒的原因，林林总总。聊举数例，点到即止。
1、配料工艺。
如配料的水温、加料的顺序、活性炭的吸附时间和温度、料液放置时间，等。
2、物料稳定性
有的原料存在多晶型，不同晶型的稳定性是不一样的；有的原料对温度敏感；有的原料对pH敏感；有的原料对氧化敏感，等。不稳定性物质的分解物很可能就是异物的来源。

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小中大

3、料液性质
料液的浓度是个很重要的因素，这个恐怕不需要强调了。
此外，对于料液的 pH稳定性也要给予足够的重视。比如，使用缓冲对时，分析课本上的三大原则要谨记：pka尽量接近于pH，尽量使缓冲比接近于1，浓度适当地大。
4、辅料性质（如挥发性等）
最明显的就是盐酸、碳酸氢钠等例子。
5、预冻
关于快冻、慢冻等老生常谈的话题不提也罢，倒是反复预冻有点意思。反复预冻可以减小由于成核温度差异造成的冰晶尺寸差异及干燥速率的不均匀性，提高干燥效率和制品均匀性；强化结晶，使结晶成分和未冻结水的结晶率提高。大家可以在实践中揣摩一下它的妙处。
6、升华
升华速度和温度对澄清度会有影响，我了解到的情况主要有以下两点。
第一，主要是一次升华期。如果率先干燥的上层物料温度上升得过快，达到坍塌温度时，多孔性骨架刚度降低，干燥层内的颗粒出现脱落，会封闭已干燥部分的微孔通道，阻止升华的进行，使升华速率减慢，甚至使下层部分略微萎缩，影响制品残留水分的含量，导致复水性、稳定性和澄清度同时变差。
第二，主要是二次升华期。小晶体由于具有很高的表面能，在热力学上是不稳定的，尤其是快速冷却过程中形成的小冰晶，在加热时有可能会发生再结晶，小冰晶之间相互结合形成大冰晶，使其表面积与体积之比达到最小，而大冰晶使冻干品外观不好，复水性差。因此，过高温度或过长时间地升华或保温，有时候会对某些品种不利，最明显的例子就是澄清度不合格。
7、制品成型性、残留水
有的品种，不怕空气，就是怕温度或水分。一旦获得了水和温度，变化就很迅速了。
8、真空、充氮
有没有抽真空，有没有充氮，能否将制品与氧气彻底隔离起来，避免缓慢氧化，有时候显得格外重要的。
9、内包材
最常见的例子就是胶塞。
胶塞不仅可能吸附主药，还可能含有许多助剂，比如硫化剂。
丁基橡胶药用瓶塞的生产过程中少不了硫化。在其硫化过程中，不同的硫化体系，其生成的交联键型和可迁移物质的不同，这样胶塞在储存、高温消毒、药品封装中，低聚物的迁移性分子键联的稳定性均不同，从而影响药物的相容性。
此外，在瓶塞的生产、加工，包装、储运等过程中，均不可避免地会发生瓶塞与设备之间，瓶塞与瓶塞之同曲摩擦，这些摩擦不可避免地产生了微粒。因此，作为制剂企业，如何避免胶塞清洗过程中的过多摩擦，也是车间技术人员需要注意的地方。
还有瓶塞的透气性，透水性易造成对水份敏感的制剂吸潮变质。作为制剂厂，我们至少要保证清洗以后的胶塞能得到良好的烘干。
10、结晶原理
无论是小水针还是冻干品，都经常听见谁在求助某某品种出现澄清度或可见异物不合格。我猜想，有一部分原因可能与结晶有关。一般来说，浓度较高的料液中的可溶性粒子都具有成为结晶理论中的核前缔结物的可能，当具备一定的形成结晶的条件时，这些核前缔结物就会不断合并，形成晶核。晶核一旦产生，晶体就生长起来了。
结晶原理告诉我们，无论是晶体生长线速率，或是晶体生长的质量速率，都取决于溶液的过饱和度或熔体的过冷度，取决于温度、压力、液相的搅拌强度及特性、杂质的存在等。
（1）搅拌能促进扩散加速晶体生长，但同时也能加速晶核的形成。
（2）温度升高有利于扩散，也有利于表面化学反应速度提高，因而使结晶速度增快。
（3）过饱和度增高一般会使结晶速度增大，但同时引起黏度增加，结晶速度受阻。
（4）至于杂质，其作用机理则是比较复杂的。下面重点阐述：
无机的和有机的可溶性杂质，可以对过饱和度、新相晶核形成以及晶体生长产生很大的影响。这些作用的机理也许是不同的，它既取决于杂质和结晶物质的性质，也取决于结晶的条件。
当杂质存在时，物质的溶解度可能发生变化，因而最终导致溶液的过饱和度发生变化。溶解度变化的原因可能不同，既可能是出现盐析效应，溶液的离子力作用，也可能出现化学相互作用。
杂质也可能与所生成的新相晶粒直接作用。可能是杂质粒子直接参与核前缔合物的长大过程，也可能吸附于结晶中心的表面上。同时，成核的速度可能因此而减慢，也可能加快。
杂质还可能导致结晶物质的晶形的变化，具体地说，导致晶面大小比例的变化。举例来说，从不含杂质的氯化铵溶液中结晶得到的是数枝状晶体，但是在含有杂质的氯化铵溶液中，树枝状的晶体分解为单独的箭形和十字形的连生体，甚至渐变为荷叶形、玫瑰花瓣形晶体，至于最终变成哪种形状的晶体，取决于杂质的浓度。晶面形状开始发生变化时的杂质浓度，称为限界浓度。（注意：晶形不同于晶体型，晶形的变化是指晶面大小比例的变化，晶面大小比例的变化无论如何也不会影响晶格结构，也就是晶型，无论晶面形状发生什么变化，晶格结构都是一样的。）

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牛血清的作用与质量要求

生物技术已经被世界各国视为一种高技术，在整个科学技术中占据了特殊的显著地位，特别是生命科学的发展更离不生物技术，生命科学的发展备受各国的重视。我国在很多大学中都设立了生命科学院。现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。细胞培养的发展，培养基的质量又是关键，而培养基的主要成份中动物血清对细胞的生长繁殖发挥着重要甚至是难以替代的作用。在动物血清的应用中牛血清又是最为广泛的，所以牛血清是医药生物技术产品中重要的原材料之一。保证牛血清质量也是促进生物制品质量提高的重要环节。
一、牛血清在细胞培养基中的主要功能
牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，具有极为重要的功能。
1.提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。
2. 提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。
3.有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。
4.是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。
5.起酸碱度缓冲液作用。
6.提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。
二、牛血清的主要成份
血清是一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已为人所知，但还有一部分尚不清楚，而且血清组成及含量常
随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。
1.蛋白质是牛血清中主要成份。除包括可携带金属离子、脂肪酸和自身是激素类蛋白外主要还有白蛋白，球蛋白。
纤维粘连素细胞促进细胞附着；
α2 巨球蛋白抑制胰蛋白酶的作用；胎牛血清中含胎球蛋白促细胞附着；转铁蛋白能结合铁离子，减少其毒性
和被细胞利用。
2.多肽：血小板促生长因子能促细胞分裂，是多肽家庭的主要成员之一，是主要的促细胞增殖因子；成纤维细胞
生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子等，血清中含量虽很少，但对细胞生长也有一定作用。
3.激素：激素对细胞的作用是多方面的。
胰岛素：促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸，与促细胞分裂有关。
类胰岛素生长因子：能与细胞表达的胰岛素受体结合，从而有胰岛素同样的作用。
促生长激素：促细胞增殖效应。
氢化可的松：血清中含有定量的该成分，它可能兼有促细胞贴附和增殖作用，但有人证明，血清中的氢化可的松
，如细胞密度高时可能有抑制细胞的作用和诱导其发生分化。
4其他成份
氨基酸、葡萄糖、酮酸等对多种营养成分的合成培养基意义不大。与蛋白相结合状态的微量元素对细胞培养有意
义。
三、牛血清的质量要求
随着科学技术的发展和生活水平的不断提高对生物医药产品的质量要求也越来越高，所以对制备工艺中所涉及到
的各种原材料的质量标准要求也越来越高，特别是对用于细胞培养基中的主要天然成份――牛血清的质量要求也
不断提高。牛血清包括胎牛血清、新生牛血清和成牛血清。
（一）、WHO公布的《用动物细胞体外培养生产生物制品规程》中的要求：
1. 牛血清必须来自有文件证明无牛海绵状脑病的牛群或国家。并应具备适当的监测系统。
2.有些国家还要求牛血清来自未用过反刍动物蛋白饲料的牛群。
3.证明所用牛血清中不含对所生产疫苗病毒的抑制物。
4.血清要通过滤膜过滤除菌，保证无菌。
5.无细菌、霉菌、支原体和病毒的污染，有些国家要求无细菌噬菌体污染。
6.对细胞有良好的支持繁殖作用。

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（二）、我国在对牛血清的质量2000年版《中国生物制品主要原辅料质控标准》中提出比较严格的标准要求。包
括蛋白质含量，细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、细菌内毒素，支持细胞增殖检查。
（三）、美国对牛血清的质量要求：Gibco 和Sigma二家主要的美国牛血清供应商的牛血清都已进入到我国市场，
他们对其质量标准要求都极为严格，从血清来源到产品质量都有明确规定。
1）血清来源：可从世界各国收集胎牛血清，但是必须符合他的质量标准和美国农业部进口要求。地方当局还不
清楚本地是否有牛海绵状病毒流行的血清不收集，有说明血清质量的证明资料：包括收集过程的全部资料、检验
结果和交付情况。
2）血清的收集：胎牛血清是心脏穿刺取血，新生牛（10～14天）和小牛（10个月内）血清静脉取血。血清采集条
件必须符合工业生产的标准：低温下采集、一次分离、分离后立即混合冻存。符合要求的血清56℃水浴30分钟灭
活。
3）血清的制备：
a. 超低IgG胎牛血清：通过亲和层析工艺去除胎牛血清中的γ球蛋白，使FBS γ球蛋白含量减到最低，一般IgG≤5ug/ml，生物学活性不变。
b. 血清透析：用12000～14000分子量的透析膜在0.15M NaCl中透析直到使葡萄糖含量＜0.5mg/ml（用葡萄糖氧
化酶／过氧化酶方法测定）。
c. γ－射线照射：已经证明γ－射线照射可以有效灭活血清中可能污染的病毒、支原体。照射剂量为30～45KG。
而且这个剂量的γ－射线照射不会改变血清的理化性质和对细胞培养的影响。
4）除菌过滤:经过上述处理的粗制血清再经过一系列除菌滤膜过滤包括0.2微米（micron）和0.1微米滤膜。FBS要
通过三层0.1微米滤膜，其他血清可通过0.2微米滤膜。
4.终产品血清质量
1）化学检定：渗透压
pH
蛋白含量――电泳法
白蛋白球蛋白血红蛋白
随着牛年龄增加血清中总蛋白含量相应增加，总的血清蛋白含量可以确定产品规格和年龄。
2）微生物学检查：细菌、真菌符合USP标准。
支原体：在支原体专业培养基上培养了3～4周，培养温度36℃±2℃
分别在需氧和厌氧条件下进行，有的还需要在支原体琼脂培养皿上传4次，Hoechst荧光素DNA染色检查那些培养法
无法检出的支原体如猪鼻支原体等。
病毒检查：
牛兰舌病毒 Bovin blue tongue
牛腺病毒 Bovine Adenovirus
牛细小病毒 Bovine Parvovirus
牛病毒性腹泄病毒 Bovine Viral Diarhea Virus
狂犬病病毒 Rabies
呼肠弧病毒 Reovirus
牛呼吸道合胞病毒 BRSV
副流感病毒Ⅲ型 Parainfluenza
检查方法：
已证明无外源因子污染的牛细胞培养物，在细胞生长液中加15％待测血清，连传3代共21天。阴性对照细胞培养液
中加15％已知无病毒污染的牛血清，与试验组同条件下进行。在观察期内注意细胞形态变化或细胞病变。在观察
期内第14天待检样品和对照样品用标准病毒检测方法检查。
如待检细胞培养物经胰酶消化后分种到6个含盖玻片的容器内。阴性对照样品按同样方法。再将牛腹泄病毒、牛细
小病毒、牛腺病毒、狂犬病毒和呼肠弧病毒分别加入待检培养物盖玻片容器内作为阳性对照，再培养7天，用荧光
抗体技术进行检查。
细胞病变或病毒引起的其他改变通过苏木精或伊红染色进行观察。取另外一个待检细胞培养瓶用人“O”红细胞、
豚鼠红细胞和新鲜鸡红细胞作血球吸附病毒检查。试验在2～8℃和20～24℃进行。阴性对照细胞预先感染副流感
Ⅲ型病毒作为阳性对照。未感染的细胞作为阴性对照。
3）内毒素检测
用鲎试剂检查。
4）细菌噬菌体检查
主要检查E.Coli(C300 or K-12)噬菌体。
5）激素含量测定
每批FBS对某些激素含量都要进行测定，包括：雌二醇、胰岛素、孕硐、睾丸素、甲状腺素等。
6）血红蛋白检测
血红蛋白与氧合血红蛋白的比≥70％，血红蛋白含量≤mg15/dl。
7）细胞生长效果测定
a.细胞克隆效果测定
细胞选择：Sp20/Ag-14 或P3X63-Ag8.653
血清浓度与细胞数:
10％血清／1个细胞／孔
4％血清／5个细胞／孔
细胞培养基RPMI－1640， 96孔培养盘36℃±2℃，5％二氧化碳培养10～
15天。试验中选择一个已知参考牛血清作对照。
克隆效率计算：
克隆效率＝(阳性孔平均数/ 培养孔总数) X100％

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相对克隆效率＝待测血清克隆效率/参考血清克隆效率
b.贴壁效率试验：
用人的传代细胞作每批血清的贴壁效率试验，A549（人肺癌细胞）该细胞可以反应出低浓度血清的贴壁变化。采
用6孔培养盘每批血清用两种浓度和两种不同的细胞接种数即10％血清――100细胞／孔，4％血清200介细胞／孔
。放36℃±2℃，湿润5％二氧化碳培养箱培养10～14天，计算着色细胞克隆，确定贴壁效率。从这两种不同血清
浓度来确立实验血清支持细胞贴壁生长的水平，分析两种试验条件下平均贴壁效率。
贴壁效率（％）＝(每孔克隆平均数/ 每孔活存的培养细胞平均数) X100％
相对贴壁效率＝被测血清贴壁效率/参考血清贴壁效率
c. 二倍体纤维细胞促生长试验
人二倍体细胞株 WI28 MRc5
25cm2细胞培养瓶，5％血清，每瓶接种1.5X105细胞连传3代，每代血清浓度和接种细胞数相同，每代培养7天，每
代接种二个细胞瓶，36℃±2℃培养。以同样条件用已知参考血清进行平行培养。每代收获细胞计数，计算每批待
检血清与参考血清的相对生长率（RGR）。
RGR＝(试验血清每瓶细胞平均数/ 参考血清每瓶细胞平均数) X100％
牛血清主要质量要求（Sigma）
胎牛血清新生牛血清成牛血清
牛龄胎 10～14天＜10个月
无菌－－－
病毒－－－
支原体－－－
噬菌体－－－
内毒素（ng/ml） ≤1.0 ≤10.0 ≤10(15)
血红蛋白（g%） 3.0～4.5 3.5～6.0 5.0～8.5
pH 6.7～8.0 7.0～8.0 7.0～8.0
渗透压（mom/Kg H2O） 240～340 240～340 240～340

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细胞培养从头学

一、常用设备
1. 准备室的设备：
单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品柜（放置消毒过的物品）、包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。
2. 培养室的设备：
液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80℃）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。
3. 必须放在无菌间的设备：
离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱（放置serum和培养用液）。

二、无菌操作
（一）无菌室的灭菌：
1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或新洁尔灭或0.5％过氧乙酸擦拭。
2.CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射。
3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟。
4.实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。
（二）实验人员的无菌准备：
1.肥皂洗手。
2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋。
3.用75％酒精棉球擦净双手。
（三）无菌操作的演示：
1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面。
2.靠近酒精灯火焰操作。
3.器皿使用前必须过火灭菌。
4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。
5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。
6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。

三、器械的清洗和消毒
（一）玻璃器械洗消：
新的玻璃器皿的洗消：
1.自来水刷洗，除去灰尘。
2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。
3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。
4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。
5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。
6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。
7.高压消毒后烘干
旧的玻璃器皿的洗消：
1．刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。
2.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次。
3.烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。
4.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向15磅时，调节电开关维持20-30分钟即可。（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）
5.烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。

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（二）金属器械洗消：
金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压（30分钟）消毒，再烘干备用。
（三）橡胶和塑料：
橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序：
1. 针式滤器帽不能泡酸液，用NaOH泡6-12小时，或者煮沸20分钟，在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。
2. 胶塞烘干后用2％氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处理30分钟），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。
3. 胶帽，离心管帽烘干后只能在2％氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。
4. 胶头可用75％酒精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可。
5. 塑料培养瓶，培养板，冻存管：
6. 其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用70％酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用2—3周时间洗除残留的氧化乙烯。用20000—100000rad的r射线消毒塑料制品效果最好。为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制：氯化钻(CoC12•6H2o)2g，30％盐酸10m1，蒸馏水88m1。

注意事项：
1.严格执行高压锅的操作规程：高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。
2.安装滤膜时注意光面朝上：注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。
3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡：A.泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体。B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸不彻底。

四、细胞培养用液的配制与消毒
器材与试剂：干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。
具体步骤：
（一）水的制备：
细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水
（二）PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：
1.溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4•H2O 1.56g，KH2PO40. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。
2.移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。
（三）胰蛋白酶溶液的配制与消毒：
胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于4℃内过夜。
2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。
（四）青、链霉素溶液的配制于消毒
1.所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。
2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。
3.使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位＝1微克？
（五）RPMI1640的制备与消毒：
1.溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中，并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中)，充分搅拌至粉剂全部溶解，并按照包装说明添加一定的药品。然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml，使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。最后定容至1000ml，摇匀。
2.安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。
3.抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。
4.分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。
5.使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃时两周有效）。

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（六）血清的灭活：
细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56℃水浴中灭火30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。
（七）HEPES溶液：
HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。
1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下：准确称取HEPTS 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌，分装后4℃保存。注意：因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20mmol/L 。如：称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，过滤除菌后可完全（20ml）加入1L培养液中，或者每100ml培养液中加入2ml即可。
（八）谷氨酰胺：
合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃下放置1周可分解50％，故应单独配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为1～4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。
（九）肝素溶液的配制：
含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为℃。使用时，向100ml培养液中加入1ml（精确可加入0.9ml）即可。
（十）Ⅰ型胶原酶：
0.1％Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20℃保存。
（十一）明胶溶液：
因为明胶难于过滤，所以配制0.1％明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量0.1克（配成100ml溶液）—即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是0.1的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌分装入50ml小瓶中，4℃保存。
（十二）其他培养用液的配制：
20ug/ml内皮生长因子

注意事项：
1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。
2.安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米和0.22微米滤膜各一张，放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。
3.配制RPMI1640培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液PH值最终为7.2，可在配制时调PH至7.4。

五、细胞传代培养（消化法）
具体操作：
（一）传代前准备：
1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
2.用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
3.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
4.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。？？？
6.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
7.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
8.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。
（二）胰蛋白酶消化；
1.加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。
2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。
3.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。
（三）吹打分散细胞：
1.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。
2.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。
3.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。
4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
（四）分装稀释细胞：
1.分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。
2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。

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