小中大式中N0为产品除菌前的微生物数量。
N 为产品除菌后的微生物数量。
LRV用于表示过滤器的过滤除菌效率，对孔径为0.22μm的过滤器而言，要求每1cm2有效过滤面积的LRV应不小于7。因此过滤除菌时，应将待被过滤产品总的污染量应控制在规定的范围限度内。为保证过滤除菌效果，可使用两个过滤器串连过滤，或在灌装前用过滤器进行再次过滤。
在过滤除菌中，一般无法对全过程中过滤器的关键参数（滤膜孔径的大小及分布，滤膜的完整性及LRV）进行监控。因此，在每一次过滤除菌前后均应作滤器的完整性试验，即气泡点试验或压力维持试验或气体扩散流量试验。测定滤器是否符合已验证过的完整性控制标准，确认滤膜在除菌过滤过程中的有效性和完整性。完整性试验可使用完整性试验仪测定。除菌过滤器的使用时间不应超过一个工作日，否则应进行验证。
过滤系统的验证包括过滤系统对过滤液体的适应性、过滤材料对溶液的污染程度、过滤器的规格、过滤器的灭菌方法、过滤系统的完整性试验、生物指示剂试验、过滤液体的微生物含量控制及过滤时间、过滤器的使用寿命等。上述试验大部分可由滤器的生产厂商来进行。微生物挑战性试验常用的生物指示剂为缺陷假单胞菌(Pseudomonas diminuta)。
通过过滤除菌法达到无菌的产品应严密监控其生产环境的洁净度，建议在无菌环境下进行过滤操作。相关的设备、包装容器、塞子及其它物品应采用适当的方法进行灭菌，并防止再污染。
六、无菌生产工艺
无菌生产工艺系指必须在无菌控制条件下生产无菌制剂（如粉针剂）的方法，无菌分装及无菌冻干是最常见的无菌生产工艺。后者在工艺过程中须采用过滤除菌法。
无菌生产工艺应严密监控其生产环境的洁净度，并应在无菌控制的环境下进行过滤操作。相关的设备、包装容器、塞子及其它物品应采用适当的方法进行灭菌，并防止被再次污染。
无菌生产工艺过程的无菌保证应通过培养基无菌灌装摸拟试验验证，试验结果的阳性率不得超过0.1%(置信度取95%)。值不得低于3。因此在生产过程中，应严密监控生产环境的无菌空气质量、操作人员的素质、各物品的无菌性。
无菌生产工艺应定期进行验证，包括对环境空气过滤系统有效性验证及培养基模拟分灌装试验。
生物指示剂
生物指示剂系一类特殊的活微生物制成的特殊制剂品。可用于确定确认灭菌设备的性能、灭菌物品的灭菌程序的建立和有效性的验证、灭菌程序的再验证、供评估产品灭菌是否达到无菌保证要求的依据、无菌空气过滤系统的评估生产过程灭菌效果的监控等。用于灭菌验证中的生物指示剂一般是细菌的孢子。
选择制备生物指示剂用微生物的基本要求
不同的灭菌方法使用不同的生物指示剂，制备生物指示剂所选用的微生物必须具备以下特性：
(1) 菌种的耐受性应大于需灭菌产品中所有可能被污染微生物的耐受性。
(2) 菌种应无致病性。
(3) 菌株应稳定。存活期长，易于保存。
(4) 易于培养。若使用休眠孢子，生物指示剂中休眠孢子含量要在90%以上。
1. 生物指示剂的制备
生物指示剂的制备应按一定的程序进行，制备前，应需先确定所用微生物的特性，如D值（微生物的耐热参数，系指一定温度下，将微生物杀灭90%所需的时间，以分表示）值等。
菌株应用适宜的培养基（如产孢子的培养基）进行培养。培养物应制成悬浮液，其中孢子的数量应占优势，孢子应悬浮于无营养的液体中保存。
生物指示剂中包含一定数量的一种或多种孢子，可制成多种形式，通常是将一定数量的孢子附着在无生命的载体上，如滤纸条、玻片、不锈钢、塑料制品等；孢子悬浮液也可密封于安瓿中；有的生物指示剂还配有培养基系统。生物指示剂应选用合适的材料包装进行包装以防止微生物的污染和孢子损耗，，并确定设定有效期。载体和内层包装材料在保护生物指示剂不被污染和损耗的同时，还应保证灭菌剂穿透必须保证灭菌因子易穿透包装内的微生物部位并能与生物指示剂充分接触、不得有任何污染物、在灭菌过程中不被破坏，否则将影响生物指示剂有效性、稳定性及使用。同时载体和包装应设计应原则是便于贮存、运输、取样、转移接种，并能避免这些过程微生物的污染和孢子的损耗。
有些生物指示剂可直接将孢子接种至液体灭菌物或具有与其相似的物理和化学特性的替代品中。此时必须论证替代品对孢子的生长繁殖没有影响及孢子的耐受力没有降低。使用替代品时，应用数据证明二者的等效性。
2. 生物指示剂的应用
在灭菌程序的验证中，尽管可通过灭菌过程某些参数的监控来评估灭菌效果，但生物指示剂的被杀灭程度，则是评价一个灭菌程序有效性更好的最直观的指标。灭菌用的生物指示剂可来源于使用商品化市售的标准生物指示剂，或是也可使用由日常生产污染菌监控中分离的最耐受微生物制备的孢子并经实验室制备而得。在生物指示剂验证试验中，需确定孢子在实际灭菌条件下的耐受性，并测定孢子的纯度和数量。验证时，生物指示剂的微生物用量应比日常检出的微生物污染量大，耐受性强，以保证灭菌程序有更大的安全性。在终端最终灭菌法中，生物指示剂应放在灭菌柜中灭菌因子最不易到达的部位（最冷点）的不同部位。若正常生产中需要用生物指示剂进行灭菌效果监测时，应注意放置方式并避免指示剂直接接触到被灭菌物品。生物指示剂按设定的条件灭菌后取出，分别置培养基中培养，确定生物指示剂中的孢子是否被完全杀灭。
过度杀菌杀灭产品灭菌验证一般不考虑微生物污染水平，可采用商品化市售的生物指示剂。对灭菌手段耐受性差的产品，设计灭菌程序时，根据经验预计在该生产工艺中产品微生物污染的水平，选择生物指示剂的菌种和孢子数量。这类产品的无菌保证应通过监控每批灭菌前的微生物污染的数量和、耐受力性、和灭菌程序验证所用的生物指示剂数量和耐受力及其他相关的参数获得的数据进行评估。
3.常用生物指示剂
(1)蒸汽湿热灭菌法：蒸汽湿热灭菌法最常用的生物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus stearothermophilus，如NCTC 10 007、NCIMB 8157、ATCC 7953)。D值为1.5～3.0min，每片（或每瓶）活孢子数5×105～5×106个，在121℃、19min下应被完全杀灭。另外此外，还可使用生孢梭菌孢子(Spores of Clostridium sporogenes如NCTC 8594、NCIMB 8053、ATCC 7955)，D值为0.4～0.8min。
(2)干热灭菌法：干热灭菌法最常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus subtilis，如NCIMB 8058、ATCC 9372)。D值大于1.5min，每片活孢子数5×105～5×106个。去热原验证时使用大肠杆菌内毒素（Escherichia coli endoxin），加量不小于1000细菌内毒素单位。
(3) 辐射灭菌法：辐射灭菌法最常用的生物指示剂为短小芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus pumilus，如NCTC 10 327、NCIMB 10 692、ATCC 27 142)。每片活孢子数107～108，置于放射剂量25kGy条件下，D值约3kGy。但应注意灭菌产品中所负载的微生物可能比短小芽孢杆菌孢子显示更大强的抗辐射力。因此短小芽孢杆菌孢子可用于监控灭菌过程，但不能用于灭菌辐射剂量的建立。
(4) 气体灭菌法：环氧乙烷灭菌最常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus subtilis，如NCTC 10 073、ATCC 9372)。气态过氧化氢灭菌最常用的生物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus stearothermophilus，如NCTC 10 007、NCIMB 8157、ATCC 7953)。每片活孢子数1×106～5×106个。环氧乙烷灭菌中，枯草芽孢杆菌孢子D值大于2.5min，在环氧乙烷浓度为600mg/L，相对湿度为60%，温度为54℃下灭菌，60min应被杀灭。
⑸ 过滤除菌法：过滤除菌法最常用的生物指示剂为缺陷假单胞菌(Pseudomonas diminuta,如ATCC19 146)，用于滤膜孔径为0.22μm的滤器；黏质沙雷菌(Serratin marcescens)(ATCC 14 756)，用于滤膜孔径为0.45μm的滤器 。
