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标题:【转帖】液相色谱—质谱联用的原理及应用

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发表于 2015-3-25 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

碰撞诱导解离CID质谱：

选择一定质量的离子作为母体离子，进入碰撞室，室内充有靶子反应气体(碰撞气体： N2、He、Ar、 Xe、CH4等) ，发生离子—分子碰撞反应，从而产生‘子离子’，再经MS2的分析器及接受器得到子离子质谱，一般称做CID (collision-induced dissociation)谱

影响CID质谱的因素：

较大影响的因素有：所用碰撞气体的种类，压力，离子的能量，仪器的配置以及离子电荷状态

由于在不同的仪器上不可能在完全相同的条件下去分析样品，任何一个给定的化合物将在不同的条件下给出差别或大或小的质谱，尤其是各个离子峰的相对丰度的差别几乎是无法避免的。因而目前尚难以建立商品化的谱库供检索使用，只能进行人工解析或自己建库。

大气压电离技术中产生的离子为偶数电子离子，其主要的碎片应由化学键的诱导断裂和重排反应来产生，所以在EI质谱解析中总结出的偶数电子离子的开裂规则一般可适用于CID质谱的解释。
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发表于 2015-3-25 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
检测接收器：

接收离子束流的装置，有：电子倍增器、光电倍增器、微通道板

数据及供电系统

将接收来的电信号放大、处理并给出分析结果及控制质谱仪个部分工作。

从几伏低压到几千伏高压。

LC-MS分析条件的选择和优化

1.接口的选择：

            ESI适合于中等极性到强极性的化合物分子，特别是那些在溶液中能预先形成离子的化合物和可以获得多个质子的大分子（如蛋白质）

            APCI不适合可带多个电荷的大分子，其优势在于弱极性或中等极性的小分子的分析。

2.正、负离子模式的选择：

　选择的一般原则为：

正离子模式：适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品加以酸化。样品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式。

负离子模式：适合于酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进行碱化。样品中含有较多的强伏电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模式。
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发表于 2015-3-25 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

3.流动相的选择

常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物以及一些易挥发盐的缓冲液，如甲酸铵、乙酸铵等，还可以加入易挥发酸碱如甲酸、乙酸和氨水等调节pH值。

LC／MS接口避免进入不挥发的缓冲液，避免含磷和氯的缓冲液，含钠和钾的成分必须＜lmmol/l。（盐分太高会抑制离子源的信号和堵塞喷雾针及污染仪器）含甲酸（或乙酸）＜2％。含三氟乙酸≤0.5％。含三乙胺＜l％。含醋酸铵＜10一5 mmol/l。

送样前一定要摸好LC条件，能够基本分离，缓冲体系符合MS要求。

4.流量和色谱柱的选择

不加热ESI的最佳流速是1—50ul／min，应用4.6 mm内径LC柱时要求柱后分流，目前大多采用 l—2.1 mm内径的微柱，TIS源最高允许lml／min，建议使用200—400ul／min

APCI的最佳流速～lml／min，常规的直径4.6mm柱最合适。

为了提高分析效率，常采用＜ 100 mm的短柱（此时UV图上并不能获得完全分离，由于质谱定量分析时使用MRM的功能，所以不要求各组分没有完全分离）。这对于大批量定量分析可以节省大量的时间。

5.辅助气体流量和温度的选择

雾化气对流出液形成喷雾有影响，干燥气影响喷雾去溶剂效果，碰撞气影响二级质谱的产生。

操作中温度的选择和优化主要是指接口的干燥气体而言，一般情况下选择干燥气温度高于分析物的沸点20℃ 左右即可。对热不稳定性化合物，要选用更低的温度以避免显著的分解。

选用干燥气温度和流量大小时还要考虑流动相的组成，有机溶剂比例高时可采用适当低的温度和流量小一
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发表于 2015-3-25 15:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
样品的预处理：

为什么要进行样品的预处理：

从保护仪器角度出发，防止固体小颗粒堵塞进样管道和喷嘴，防止污染仪器，降低分析背景，排除对分析结果的干扰。 要求获得最佳的分析结果，从ESI电离的过程分析：ESI电荷是在液滴的表面，样品与杂质在液滴表面存在竞争，不挥发物（如磷酸盐等）防碍带电液滴表面挥发，大量杂质防碍带电样品离子进入气相状态，增加电荷中和的可能。

样品的预处理常用方法

a）超滤

b）溶剂萃取／去盐

c）固相萃取

d）灌注（Perfusion）净化／去盐

e）色谱分离

   反相色谱分离

   亲和技术分离

f）甲醇或乙腈沉淀蛋白

g）酸水解，酶解

h）衍生化
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发表于 2015-3-25 15:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

化合物鉴别

全扫描方式（Q1扫描）

全扫描数据采集可以得到化合物的准分子离子，从而可判断出化合物的分子量，用于鉴别是否有未知物，并确认一些判断不清的化合物，如合成化合物的质量及结构。

子离子分析（ MS/MS ）

子离子，用于结构判断(得到化合物的二级谱图即碎片离子)和选择离子对作多种反应监测（MRM）。

子离子谱图与锥体电压断裂谱图（源内CID）可能十分相似，所不同的是子离子质谱图已知只有一种质量通过MS1，因此也已知所有碎片离子都是由我们所选定的母离子所产生的，所以我们更相信由MS/MS产生的谱图的纯度。

用大气压电离质谱仪可以得到分子量信息

正离子方式常出现如下离子:

-Na 22 Da. higher than M+H

-K 38 Da. higher than M+H

-Li 6 Da. higher than M+H

-NH4 17 Da. higher than M+H

-ACN 40 Da. higher than M+H

2M+H,2M+Na等

负离子方式常出现如下离子:

-TFA 114 Da. higher then M-H (113 and 227 background)

-Acetate 60 Da. higher then M-H

-Formic 46 Da. higher then M-H

-Cl 36 Da. higher than M-H
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发表于 2015-3-25 15:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

分子量测定中的误判

溶剂中的杂质

来自于塑料添加剂的峰

样品容器不干净，常见表面活性剂的峰

进样系统污染

样品在源内碎裂，形成碎片离子

LC-MS中常见的本底离子

m/z 50-150, 溶剂离子，[(H2O)nH+  ，n= 3-112]

m/z 102, H+乙腈 +乙酸, C4H7NO2H+,102.0549

m/z149, 管路中邻苯二甲酸酯的酸酐, C8H4O3H+,149.0233

m/z 288, 2mm 离心管的产生的特征离子

m/z 279, 管路中邻苯二甲酸二丁酯 C16H22O4H+, 279.1591

m/z 316, 2mm 离心管的产生的特征离子

m/z 384, 瓶的光稳定剂产生的离子

m/z391, 管路中邻苯二甲酸二辛酯, C24H38O4H+, 391.2843

m/z413, 邻苯二甲酸二辛酯+钠, C24H38O4Na+, 413.2668

m/z 538, 乙酸+氧 +铁（喷雾管）, Fe3O(O2CCH3)6, 537.8793

分子量测定失败的原因

a）流动相不合适

b）不挥发性盐的影响

c）成分复杂，杂质太多

d) 样品浓度不够

e）pH值不合适

f）样品在源内分解或碎裂
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 小中大

目标化合物分析

（1）选择离子监测（SIM）

      SIM用于检测已知或目标化合物，比全扫描方式能得到更高的灵敏度。这种数据采集的方式一般用在定量目标化合物之前，而且往往需要已知化合物的性质。



      若几种目标化合物用同样的数据采集方式监测，那么可以同时测定几种离子.

（3）母离子扫描

母离子分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物，尽管它们的母离子的质量可以不同，但在分裂过程中会生成共同的子离子，这种扫描功能在药物代谢研究中十分重要。



(4)中性丢失扫描

   中性丢失扫描分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物，例如新生儿遗传疾病筛查中某些检测项目。也可以帮助进行未知物结构判断，例如有中性丢失18Da的意味着-H2O，28-CO，30-HCOH，32-CH3OH，44-CO2等等。
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 小中大
天然产物天然药物的研究

目前中药开发研究有两条途径。一条途径是从单一植物中提取一种有效成分(单体化合物)或提取物开发成新药。另一途径则是中药复方制剂的开发研究。

采用现代多种仪器联用新技术，特别是高效液相色谱/质谱/质谱联用(HPLC-MS/MS)，可对其十几种乃至几十种化学成分进行指纹图谱分离鉴定。再从指纹图谱中选择四、五种指标成分(有效成分或特征成分)进行定量，可以确定出简化的指纹图谱和指标成分，又是最合理的中药复方质量控制的方法，是研究中药复杂体系，尤其是复方的有力工具。国内外很多学者已进行了复方丹参、清开灵、泻心汤、人参或党参制剂等中药中的主要成分的分析。

临床诊断和疾病生物标志物的分析

欧美等目前已广泛采用HPLC/MS/MS法用于临床诊断以及疾病生物标志物的研究、检测，具有专一性好、灵敏度高、成本低、分析快速，经济效益可观等特点。目前可进行新生儿遗传疾病筛选（PKU、MCAD等四十种左右）、新生儿性激素变异的检测、男女激素的监测、老年痴呆症的早期诊断、抗排异药物的检测、磷酸脂的检测、血红蛋白变异检测、糖化血红蛋白（糖尿病早期检测）、某些心脏病、癌症疾病筛查如乳腺癌等等（Biomarker法、通过鉴定DNA损伤程度测定）、药物剂量监测、药物相互作用监测、地区性突发性中毒病人的毒物检测等。
残留、法医学和环境样品测定

专家指出，中国入世后，食品工业最大的问题就是"安全壁垒"，这将给中国的进出口和国内企业带来极大的威胁。美国食品与药品管理局 (FDA)、欧盟、日本、韩国等主要贸易国和地区公布了在进口动物源性食品中禁止使用的药物名单，提高了最高限量标准。这就要求中国加强农、畜、水产品中的农药、兽药等残留的控制和检测。

同样随着人类对生存环境的倍加关注，要求对环境中各种污染物、有害或有毒物以及法庭科学中毒物、滥用药物等进行更加严格的监控。而配以ESI、APCI和APPI离子化技术的LC/MS/MS以分析速度快、灵敏度高、特异性好等特点广泛应用与残留和毒物分析。目前已成功地进行数百种农药、兽药、抗生素、兴奋剂类残留和毒物、毒素如氯霉素、磺胺类、硝基呋喃类、毒品、多环芳烃等等化合物的检测。
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