小中大稻壳巴巴《牛奶中活性物质的分析》从牛奶中分离酪蛋白和乳糖
一、引言
牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白,含量约为35g/l。酪蛋白在乳中是以酪蛋白酸钙-磷酸钙复合体胶粒存在,
胶粒直径约为20~800纳米,平均为100纳米。在酸或凝乳酶的作用下酪蛋白会沉淀,加工后可制得干酪或干酪素。本实验利用加酸,当达到酪蛋白等电点PH=4.7时,酪蛋白沉淀。脱脂乳中除去酪蛋白后剩下的液体为乳清,在乳清中含有乳白蛋白和乳球蛋白,还有溶解状态的乳糖,乳中糖类的99.8%以上是乳糖,可通过浓缩、结晶制取乳糖。
二、实验材料和试剂
脱脂乳或脱脂奶粉。
醋酸-醋酸钠缓冲溶液(PH=4.7),95%乙醇,乙醚,碳酸钙粉末,苯肼试剂。
三、实验步骤
1. 从牛奶中分离酪蛋白
在烧杯中加入2g脱脂奶粉,再加入40ml40℃,PH=4.7的醋酸-醋酸钠缓冲溶液40ml,
用PH精密试纸检验液体的PH值。静置冷却至室温,倾去上层清液(留作分离乳糖用),剩下的悬浮液分别装入两支离心试管中,用转速为2000转/分离心分离3~5分钟,倾出上层清液,(合并于上一清液中),得酪蛋白粗品。于离心管中加入5ml蒸馏水,用玻棒充分搅拌,洗涤除去其中的水溶性杂质(如乳清蛋白,乳糖以及残留的缓冲溶液),离心后弃去上层液,再用蒸馏水洗一次。于试管中加入5ml95%乙醇,充分搅拌,离心后弃去乙醇溶液,用乙醇洗涤主要是除去磷脂类物质。最后再用5ml乙醚以同样方法洗涤,以除去脂肪类物质。将酪蛋白沉淀物凉干,称重、并计算得率。
2. 从牛奶中分离乳糖
在除去酪蛋白的乳清中,加入1.5g CaCO3粉末,搅拌均匀后加热至沸。加CaCO3的目的一方面是中和溶液的酸性,防止加热时乳糖水解,另方面又能使乳白蛋白沉淀。过滤除去沉淀,在滤液中加入1~2粒沸石,加热浓缩至3~5ml,加入10ml 95%乙醇(注意离开火焰)和少量活性炭,搅拌均匀后在水浴上加热至沸腾,趁热过滤,滤液必须澄清。加塞放置过夜,乳糖结晶析出,抽滤,用95%乙醇洗涤产品。
3. 乳糖成脎试验
取自制乳糖溶于少量水中,浓度约为5%,在试管中加入1ml乳糖溶液,1ml苯肼试剂①,摇匀,试管口用棉花塞住,在沸水浴中加热,并不时振摇,加热10~15分钟后,取出放置冷却,乳糖脎成结晶析出。取少量乳糖脎在显微镜下观察其结晶形态,可证实为乳糖。
①苯阱试剂有毒,小心使用,勿触及皮肤,如触及皮肤先用稀醋酸洗,再用水洗。
另外附上:
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤:
(一)材料的预处理及细胞破碎
分离提纯某一种蛋白质时,首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态,不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有:
1. 机械破碎法
这种方法是利用机械力的剪切作用,使细胞破碎。常用设备有,高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。
2. 渗透破碎法
这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
3. 反复冻融法
生物组织经冻结后,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便,但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。
4. 超声波法
使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。
5. 酶法
如用溶菌酶破坏微生物细胞等。