【求助】 PCR求助

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标题:【求助】 PCR求助

987789[使用道具]
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发表于 2015-4-1 15:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位高手请指点：
图一是我用引物跑的电泳，长度20bp。
图二：前6个条带是用第一批引物扩增的，后4条带是用第二批引物扩增出来的，引物序列是一样的，只是合成时间先后不一样。我用的pcr条件也一模一样。
图三：为了排除两批引物合成问题，我使用相同的模板（与图二前6条带的模板相同）用第二批引物扩增。结果没有条带
需指点！

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2015-4-1 15:31

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2015-4-1 15:31

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woshi[使用道具]
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发表于 2015-4-1 15:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、做个克隆测序，如果序列不对，找公司赔偿。
2、重新合成引物。

987789[使用道具]
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发表于 2015-4-1 15:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 woshi 于 2015-4-1 15:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1、做个克隆测序，如果序列不对，找公司赔偿。
2、重新合成引物。

之前有用第二批引物扩增产物，也有条带，但是很模糊，图如下，再加上图一引物跑胶的条带，是不是说明不是引物的问题呢？谢谢

附件

2015-4-1 15:31

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woshi[使用道具]
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发表于 2015-4-1 15:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 987789 于 2015-4-1 15:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

之前有用第二批引物扩增产物，也有条带，但是很模糊，图如下，再加上图一引物跑胶的条带，是不是说明不是引物的问题呢？谢谢

1.建议你做个退火的梯度PCR，看看是不是退火的问题。
2.还可以看看优化一下你的模板量，及dNTP的量。模板量太多或太少，及dNTP的量太多或太少都有可能出现这种情况。

orangecake[使用道具]
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发表于 2015-4-1 15:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

引物没有PAGE纯化

987789[使用道具]
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发表于 2015-4-1 15:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 woshi 于 2015-4-1 15:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

1.建议你做个退火的梯度PCR，看看是不是退火的问题。
2.还可以看看优化一下你的模板量，及dNTP的量。模板量太多或太少，及dNTP的量太多或太少都有可能出现这种情况。 ...

我用的PCR条件是先前老师已经摸好的，之前我用他第一批引物扩增出来产物了，后来再用第二批引物扩，刚开始有弱弱的目的条带，后来就扩不出来了。我也做了温度梯度53°-63°都有试，还是不行。我用的是天跟公司的2×Taq PCR MasterMix。我也测了DNA浓度，OD260/OD280比值都还可以。
我现在有些怀疑是不是我的试剂污染了？因为我不是无菌操作，有这种可能吗？
请问怎么优化模板？
谢谢

ha111[使用道具]
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发表于 2015-4-1 15:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

怀疑你的PCR体系有问题。看看buffer的倍数，是不是添加后的最终浓度不是1倍，按说你不会出这样低级的错误。

969[使用道具]
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发表于 2015-4-1 15:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你这是做的多态性 PCR吧。出现抹带或者条带不清晰，这是常见的现象，个人觉得主要是两个原因：PCR模板不纯或者连接之类前面的步骤没有做好，第二个就是PCR体系或者PCR的程序有问题(不是说你的体系设计和程序设计的问题，是指你加样的操作和PCR仪的重复性这方面)。至于怎样改进，还是先从模板这方面着手吧，我们实验室也经常遇见这样的情况

伊莎贝拉[使用道具]
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发表于 2015-4-1 15:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

还是听我的吧，哥很专业，这图一看十之八九就是模板有问题，很可能已经降解了，重新抽模板吧

wanglaoshi[使用道具]
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发表于 2015-4-1 15:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

貌似是降解了

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