【求助】SSR

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标题:【求助】SSR

bs4665[使用道具]
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发表于 2015-4-1 16:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

大家帮帮忙,最近试验遇到些问题。我做的是棉花纤维分子标记（SSR），现在有3个亲本有600多对引物，要筛引物可是带出的很少，要不就是一个亲本不出带，检查了DNA没问题呀，郁闷当中，快急死我了。
10微升体系：
buffer          1
dntp             0.25
taqE(500u) 0.2
引物             1
DNA             1
ddH2O          6.55

扩增程序：
95度    4分钟
94 度    40秒
51 度    45秒
72度    1分钟    35个循环
72度       8分钟
4  度       保存

junhun[使用道具]
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发表于 2015-4-1 16:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不出带是正常的最好发个图片来看看

bs4665[使用道具]
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发表于 2015-4-1 16:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 junhun 于 2015-4-1 16:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

不出带是正常的最好发个图片来看看

图片稍后附上
我想问下1、是上游引物与下游引物的退火温度不同，怎么选择？是取其平均值还是选择其中较低的退火温度？2、我有3个亲本一块PCR板上可以点32对引物，但是这些引物退火温度不一样该怎么取一个合适的温度来PCR?

DDD[使用道具]
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发表于 2015-4-1 16:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

折中选一个退火温度吧我的引物有200多对，也是合成的我选的是58°c，都还不错

hyuu[使用道具]
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发表于 2015-4-1 16:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你可以看看跟你做一样棉花ssr pcr的程序感觉你的延伸时间还是挺长的啊当然我不是做棉花的做大豆小麦的变性退火延伸都用30s 就行

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发表于 2015-4-1 16:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

向大家请教一个问题：我在跑PCR的时候，如果样少的话能够跑出来（比如只有5管），而样多的话就跑不出来（比如有40管），我是先配好体系再分装的，这个是不是照成这种现象的原因？求指点

wood533[使用道具]
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发表于 2015-4-1 16:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

DNA浓度是多少？

bs4665[使用道具]
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发表于 2015-4-1 16:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不出带是正常的最好发个图片来看看

===============================================================================================================

你好：
想咨询个事请，我做的是棉花分子标记有3个亲本，过年之前一共筛选出了60多对SSR引物，可是过完年回来后有一个亲本突然不出带了，其他两个亲本都有带，这是怎么回事呀？现在我快愁死了？DNA也是重新提的。

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发表于 2015-4-1 16:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 bs4665 于 2015-4-1 16:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
不出带是正常的最好发个图片来看看

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你好：
想咨询个事请，我做的是棉花分子标记有3个亲本 ...

是所有的引物都不出带还是只有某一对引物不出带？
要是只有某一对引物不出带建议你重P一次或许是忘记加什么了

IAM007[使用道具]
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发表于 2015-4-1 16:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你没有说明你P出来的片段大约在哪个范围内呀？
一般来说。不同的片段大小延伸温度是不一样的。预变性的温度实际上做SSR的话2min就够了。
因为SSR一般P出来的片段都在1K以下。
退火温度大家一般都会选择55度左右，太低的话，我试过很难P出条带。
要不然你试试这样的体系
我也正在做SSR，原理都是一样的
10×Buffer  1.5uL
2.5×Dntp 1.5uL
DNA          1uL
Primer       1uL(上下引物1uL，如果是混合样，就1.5uL这个关系不大啦）
Taq酶       0.2
其他的你用水，共15uL体系咯
你再把延伸温度改成40秒试试，这个是我惯用的体系，条带很清楚
但是我做的不是棉花，也不知道能不能帮到你

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