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标题:【求助】 为什么SSR扩增产物琼脂糖跑出的条带会...

veiwu[使用道具]
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发表于 2015-4-2 10:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】 为什么SSR扩增产物琼脂糖跑出的条带会...

我做红藻微卫星标记的，先用温度梯度找到合适的退火温度后再进行pcr扩增的，引物来源有EST设计和同科属的不同物种，产物应该在500bp以下才对的哇？我maker用的DL1000的，琼脂糖为1%浓度，100V电泳30min，电泳后发现，PCR扩增出来的产物居然比maker最大分子量还要大，有的是同科属的不同物种的引物，这种情况不止一对引物出现，多对引物都出现，请问到底哪里出问题了？下面是我的PCR程序和体系，谢谢指教！！！
PCR程序：94度 5min  
                 94度50s
                 退火温度 45s
                 72度 50s 30个循环
          72度 8min
PCR体系25ul：Buffer 2.5ul
                       dntp 2ul
                      Mgcl2 1.5ul
                       F 0.8ul
                      R 0.8ul
                       Taq 0.3ul
                      加水至25ul


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2015-4-2 10:07
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发表于 2015-4-2 10:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
很可能是引物的问题，设计的引物进行引物的特异性比对了吗，从条带上看，很可能是非特异性条带。
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发表于 2015-4-2 10:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 finger 于 2015-4-2 10:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
很可能是引物的问题，设计的引物进行引物的特异性比对了吗，从条带上看，很可能是非特异性条带。

我用的引物是直接别人文章里的引物，还没有设计引物！
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 小中大
一般都是在2000-100bp之间，大于你1000bp是正常的！一般是在1500-200，你换个DL2000试一下下就知道了
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发表于 2015-4-2 10:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你这跑胶结果一点都不想是SSR，到像是ISSR了。
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发表于 2015-4-2 10:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你确定你用的是SSR引物而不是ISSR引物？
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发表于 2015-4-2 10:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

引物不好  提高退火温度2--3度  或者使用降落PCR
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veiwu[使用道具]
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发表于 2015-4-2 10:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 bring 于 2015-4-2 10:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
一般都是在2000-100bp之间，大于你1000bp是正常的！一般是在1500-200，你换个DL2000试一下下就知道了

应该是在400bp以下的！！
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发表于 2015-4-2 10:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

貌似你目的片段都没扩出来，这些引物估计是用不了了（当然你用的是其他种的，可能有些插入片段上的差异，但是片段有点大了，我估计不是这个原因）。如果目的片段有出来，提高一下特异性还是有用的。我是先用比较低的温度扩，把所有引物都筛选一遍，无特异性扩增的就通过提高退火以及降低酶量还有镁离子什么的，当然前提是有目的片段。个人观点。
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