【求助】pcr求助

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标题:【求助】pcr求助

moonlight45[使用道具]
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发表于 2015-4-2 11:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位大虾好，我再试验中遇到一些pcr困难，特向你们求助

我自己设计的醛固酮合酶(CYP11B2)引物
F AGCGAGTGTTGGGTCCTCTGCT

R GAAAGCAACCTGCGGTCACAGGG

通过NCBI Primer-Blast 比对结果如下Primer pair 1
Sequence (5'->3') Length Tm GC%
Forward primer AGCGAGTGTTGGGTCCTCTGCT 22 59.85 59.09%
Reverse primer GAAAGCAACCTGCGGTCACAGGG 23 60.48 60.87%

>NM_000498.3 Homo sapiens cytochrome P450, family 11, subfamily B, polypeptide 2 (CYP11B2), nuclear gene encoding mitochondrial protein, mRNA product length = 566Forward primer 1 AGCGAGTGTTGGGTCCTCTGCT 22Template 2209 ...................... 2230Reverse primer 1 GAAAGCAACCTGCGGTCACAGGG 23Template 2774 ....................... 2752

[ 本帖最后由 moonlight45 于 2015-4-2 16:34 编辑 ]

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2015-4-2 11:20

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moonlight45[使用道具]
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发表于 2015-4-2 11:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有以下几个疑问
1 我设计的该引物的产物是否就一定是醛固酮合酶(CYP11B2）？
2 我在摸索退火温度时第2次有目的条带，但浅谈，确定Tm56度，再次提取细胞RT-PCR2遍均后无目的片段表达
3 产物二聚体严重，怎样改进？
4肯请同行指点疑问，如能提供更好的引物，万分感谢。

vcve[使用道具]
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发表于 2015-4-2 11:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好，我也不太懂，只能说自己的看法，你设计的引物合成的并非全长酶基因，仅是其中一段。引物很合适，与模板完全匹配，应该没有问题。Tm值56度也比较合适。如果换我可能选60-55度做一梯度，看看那个温度是最佳的。至于你说的引物二具体，可以不用管它。在尝试几次好了！

abc816[使用道具]
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发表于 2015-4-2 11:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

给lz几个建议，如果你按照ncbi的全基因序列设计引物的话，得到的应该改就是那个基因，用电泳检测带型大小与理论值相符就可以缺点他就是了，建议你再降低一下退火温度，最好做个梯度pcr，用nanodorp监测一下你的模板浓度，调整一下，另外你在加药的过程一定冰上进行，能减少一下引物二聚体的量

october7[使用道具]
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发表于 2015-4-2 14:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

引物二聚体一般不用考虑

2541[使用道具]
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发表于 2015-4-2 14:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

二聚体先不用管它，先得到目的条带再说。二聚体的话可以调整一下退火温度，实在不行做个梯度吧--

mickeylin[使用道具]
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发表于 2015-4-2 14:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

二聚体确实没有用其他的不懂了

dog002[使用道具]
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发表于 2015-4-2 14:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

目的带很淡啊，片段不是很长，一般pcr条件下可以获得很亮的特异带，如果目的带很淡，不大能说明问题

vvmmoy[使用道具]
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发表于 2015-4-2 14:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

出现二聚体，很可能是引物加多了

DCS[使用道具]
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发表于 2015-4-2 14:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你要是做的常规PCR，引物二聚体就不用考虑了，但是要做定量PCR的话就得把二聚体给消灭掉。一般是通过提高退火的温度，减少引物的量，增加模板的量，操作要在冰上进行，再个就是配置体系的时候要迅速，配好之后就直接PCR，中间最好不要间断，一点点个人经验。你的条带很暗，可能是模板的量太少了，也可能退火温度不适合，扩增效率低，做个梯度吧

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