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标题:【求助】关于大片段连接效率低的解决办法

小鱼鱼[使用道具]
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发表于 2015-4-2 15:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于大片段连接效率低的解决办法

各位大侠：
       小弟初来乍到，不懂规矩，望见谅！
       最近做连接转化蓝白斑筛选，阳性结果很少，可能是连接效率低的原因。目的片段约1400bp，请问如何提高连接的效率？
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pou[使用道具]
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发表于 2015-4-2 15:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你问一下你们实验室有没有人跟你用同一个连接酶，他们用的效果怎么样，连接酶会对连接效率造成很大影响；
其次在凝胶回收那一步要做好，如果回收的不好的话也会使连接效率变低。我用的是biomiga公司的回收试剂盒，效果还行。1400bp的片段应该算不上大片段，我做的是3000bp的片段
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小鱼鱼[使用道具]
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发表于 2015-4-2 15:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
他们有用同一种酶连500bp左右的片段，效果还可以。不知你们用的是什么酶啊？
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pou[使用道具]
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发表于 2015-4-2 15:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

高保真的PFU酶，北京全式金公司的，载体用的是配套的T-easy
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小鱼鱼[使用道具]
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发表于 2015-4-2 15:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的是tiagen的T4DNA连接酶，配套的pGM-T，这个不行吗？
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pou[使用道具]
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发表于 2015-4-2 15:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也不清楚，PGM-T的载体我用过，但是用的不是你前面的酶，应该是和这个载体配套一个公司的酶，具体哪一种我也不太清楚了，不好意思哦
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小鱼鱼[使用道具]
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发表于 2015-4-2 15:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 pou 于 2015-4-2 15:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我也不清楚，PGM-T的载体我用过，但是用的不是你前面的酶，应该是和这个载体配套一个公司的酶，具体哪一种我也不太清楚了，不好意思哦

嗯，没事。
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发表于 2015-4-2 15:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也遇到了相似的情况，我的目的片段是4000多大小的，载体是PMT/V5,3000多，连接了好几次效率都很低，用的是T4连接酶，这次出来张的斑很少也，以前的几次都不长斑的……
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yonger[使用道具]
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发表于 2015-4-2 15:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用好一点的连接酶吧
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chengjie79[使用道具]
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发表于 2015-4-2 15:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也是 就是连接不上 排除了很多方面 我没有凝胶回收 而是酚氯仿纯化 一直连不上 质粒也验证切开了 出来的菌做菌落PCR电泳验证条带位置就是空质粒
快郁闷死了
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