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标题:【求助】这样的结果能做DGGE吗 ？

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发表于 2015-4-2 19:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】这样的结果能做DGGE吗 ？


模板是用试剂盒提取的土壤总DNA，采用nest-pcr，得到这样的图。上面6个条带是一种土，下面12个条带是另外一种土。


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2015-4-2 19:59
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changlhsyo[使用道具]
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发表于 2015-4-2 19:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

下面的可以
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lagua123[使用道具]
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发表于 2015-4-2 20:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有很多东西你没说出来，怎么做的，反应之类的，可以纯化之后先做下试试
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发表于 2015-4-2 20:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是这样的，我补充一下，我是要做土壤真菌多样性分析的。用的真菌通用引物ITS1-F和ITS4。而且我后来仔细看电泳图中下面的条带发现其实是不在一条水平线上的，我也看了其他几次做的电泳图也有同样的问题，分别是两条短的、两条长的间隔出现的（电泳图中低低、高高的条带）。这也许和我之前土壤的处理方式有关，片段较长的样品我在土壤中加有一种有益真菌。我开始以为同样的引物扩增出来的片段理论上应该是一样长的，但是现在我想问，因为我土壤中的微生物丰富，会不会扩增出不一样长短的片段。图中上方的6个条带又是另外一种肥力更好的、微生物含量更高的土，所以条带才会更多，可不可以这样理解。
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发表于 2015-4-2 20:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 lagua123 于 2015-4-2 20:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
有很多东西你没说出来，怎么做的，反应之类的，可以纯化之后先做下试试

试剂
浓度
用量
目标浓度
模板
20ng/uL
2.5uL
50ng
Primer ITS1-F
20uM
1uL
40pM
Primer ITS4
20uM
1uL
40pM
20mg/mLBSA（仅1-6号样品加）
20mg/mL
1uL
40ug/mL
r-Taq（包含酶、NTP、buffer）
25uL
总体积
[/td]第一轮PCR[td=3,1]
50μL


第二轮PCR和第一轮基本类似，用第一轮PCR产物1uL加引物ITS-1-F+GC和ITS2。其余同上
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发表于 2015-4-2 20:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
第二轮PCR和第一轮基本类似，用第一轮PCR产物1uL加引物ITS-1-F+GC和ITS2。其余同上

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体系没有问题，看你的图也有比较浅的非特异性条带，我也不清楚会不会对DGGE有影响，毕竟DGGE敏感性要强一些。纯化一下看下吧
还有需要的话来这个群吧，可能会有人给你解答。
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发表于 2015-4-2 20:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

什么是DGGE？
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 小中大


QUOTE:
原帖由 xueyouzhang 于 2015-4-2 20:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

什么是DGGE？

DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)，即变性梯度凝胶电泳，是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。具体而言，就是将特定的双链DNA片段在含有从低到高的线性变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，随着电泳的进行，DNA片段向高浓度变性剂方向迁移，当它到达其变性要求的最低浓度变性剂处，双链DNA形成部分解链状态，这就导致其迁移速率变慢，由于这种变性具有序列特异性，因此DGGE能将同样大小的DNA片段很理想地分开，它是一种很有用分子标记方法。现已广泛应用于生物多样性调查、亲缘关系鉴定、基因突变检测等多个领域.
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发表于 2015-4-2 20:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
第二轮PCR和第一轮基本类似，用第一轮PCR产物1uL加引物ITS-1-F+GC和ITS2。其余同上

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你用25ul体系，50ul温度不准了，第二轮有可能浓度太大，你把第一轮稀释10倍用1ul，你们有好点的酶没有，用好酶做一次，祝你成功
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