小中大个人见解：
1.你的酶切位点的保护碱基设计的不合理，你可以参考NEB的酶切位点保护碱基表；
2.我下载你的附件了，你的引物设计的不论是特异性还是稳定性上都不好，里面提示你：你的Forward Primer的3'端有很严重的False Priming，而且形成的双链的ΔG =-11.0 [kcals/mol] ，退火后的双链比较稳定，很容易引起错误的聚合反应，正向引物会造出338bp的副产物,你的Marker应该是TaKaRa 100bp的吧？挨着Marker的那个样好像就有这个副产物。
3.你的Reverse Primer也不合格，3'端也有很严重的False Priming，形成的双链的ΔG =-16.2 [kcals/mol] ，退火后的双链比正向引物造出的那个还稳定，这个会造成777bp的副产物，挨着Marker的那个样的最亮的应该就是。
4.建议你重新设计引物，把引物的长度设计在26~32bp，直接两步PCR扩增就行了；或者你做TD-PCR，你现在的两条引物的Tm值都不到57℃，你在63~57℃是比较难成功的，引物最好以G\C结尾，但是3'末端的GC也别太多，容易造成非特异性扩增；
5.好像挨着Marker的那个样有你需要的产物，就是太少。
希望对你有帮助
