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标题:【求助】RT-PCR

二丫头466[使用道具]
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发表于 2015-4-28 09:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】RT-PCR

兼并引物对的退货温度分别为：45℃、52℃。目的片段大小为230bp。
RT第一链合成后，用上述兼并引物进行了3个不同的pcr程序。
1-3泳道的程序为：94℃ 1min、50℃ 2min、72℃ 1min。35 cycle（这个程序曾经能扩增出目的条带）；
4-6泳道的程序为：94℃ 1min、52℃ 1min、72℃ 1min,5 cycle；然后94℃ 1min、45℃ 1min、72℃ 1min,15 cycle；
7-9泳道的程序为：降落PCR：94℃ 1min、57℃ 1min、72℃ 1min，35 cycle，每个循环降低0.5℃。

请大侠帮我分析下失败的原因哟！


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2015-4-28 09:36
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2015-4-28 09:36
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二丫头466[使用道具]
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发表于 2015-4-28 09:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Marker 为100bp
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发表于 2015-4-28 09:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看楼主第一幅图感觉就是非特异性扩增太多。
可能仍然需要优化退火条件。
但是我一般变性退火的时间只需要30秒，不知道为什么楼主设计为1分钟或是两分钟。
还有就是230bp片段延伸时间30秒足够了，时间长了反而会有非特异性扩增。
片段太短了，引物二聚体可能和你的目的片段通过跑胶分不开。
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KGZ564[使用道具]
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发表于 2015-4-28 09:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Marker没跑开  不好看
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dior[使用道具]
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发表于 2015-4-28 09:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是没P出来吧！
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发表于 2015-4-28 09:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢大家的意见！片段太短了，引物二聚体可能和你的目的片段通过跑胶分不开。引物二聚体只有几十bp吧，目的片段230bp，应该不会分不开吧！
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二丫头466[使用道具]
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发表于 2015-4-28 09:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感觉非特意扩增很严重
如何消除非特异性扩增呢？
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发表于 2015-4-28 09:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
要消除特异性的问题得做下条件优化，不过RNA的质量也很重要
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xue258[使用道具]
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发表于 2015-4-28 09:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以换好点的酶试一次
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发表于 2015-4-28 09:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上 ，能推荐一些较好的酶吗？谢
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