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标题:【求助】请教PCR 结果问题分析

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发表于 2015-4-28 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请教PCR 结果问题分析


图1.


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HOT兔[使用道具]
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发表于 2015-4-28 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
由于上次实验没有条带，为了分析没有条带的原因 我这次用了三个样品：1）以前做过的HT29 RNA 2) 上次没有条带的SW620 RNA 3） 和1同一次提取的RNA 已经合成了CDNA。 结果如图2.


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发表于 2015-4-28 19:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我需要的条带是从上到下的 第二条
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发表于 2015-4-28 19:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
第一个条带是不是你的模板呢？模板加多了吗？
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发表于 2015-4-28 19:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的退火温度可能太低，二聚体较多；引物特异性应该不是很强，把非目的条带也扩出来了。如果你是需要目的条带做后续试验，直接把胶割下来回收就行了，第一条带不用管，或者换一对引物试试。
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发表于 2015-4-28 19:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能原因：1.引物的特异性不够，2.退火温度过低。
可以尝试：1.重新合成引物，2适当提高退火温度。
不过楼主还是扩增除了想要的条带，如果有后续试验，可以对目的条带进行回收，不用管非特异性条带!
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发表于 2015-4-28 19:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

退火温度依次递减 会不会好一些呢
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发表于 2015-4-28 19:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
提高退火温度。要不把目的条带回收回来做模板再重新PCR。
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S6044[使用道具]
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发表于 2015-4-28 19:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
引物特异性不好
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HOT兔[使用道具]
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发表于 2015-4-28 19:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 yizhi 于 2015-4-28 19:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你的退火温度可能太低，二聚体较多；引物特异性应该不是很强，把非目的条带也扩出来了。如果你是需要目的条带做后续试验，直接把胶割下来回收就行了，第一条带不用管，或者换一对引物试试。 ...

换了引物做了一下 结果挺好的 呵呵 谢谢
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