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标题:【求助】我想问一个关于PCR的问题?

xevin[使用道具]
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发表于 2015-4-29 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】我想问一个关于PCR的问题?

我现在做的是菌种的16SDNA的鉴定,可是我在对提到的总DNA进行到16SDNA的pcr扩增时,琼脂糖电泳却显示没有扩增出来,请各位大虾,给我分析以下是什么原因. 谢谢先.
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KGZ564[使用道具]
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发表于 2015-4-29 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

三个环节：1） rDNA提取；2）PCR;3)电泳检测。其中任何一个环节出问题都会导致你看到的现象。
1）rDNA提取，如果是E.coli之类的菌，可以不提取基因组DNA，直接用菌体PCR。当然，提取模板要好一些，可以用Kit。
2）PCR，建议设立对照，一方面检验模板质量，另一方面检验PCR系统。对照可以是rDNA的其他区域特异的引物，也可以是其他基因。如果对照没有问题，焦点就集中到了你的PCR条件，如引物设计和PCR反应的条件设定。
3）电泳系统，相信不会有问题，通过marker可以看出来。
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2015-4-29 11:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得最主要的是DNA的提取，如果DNA在提取过程中降解了，那PCR怎么做都不会出结果。DNA提取的关键是溶菌酶消化，37度，2个小时。在酚氯仿提取时，要动作轻柔，旋8字混匀。总DNA很容易断裂。提取结束后，最好跑电泳来鉴定，如果成了smear,那就完了。
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xevin[使用道具]
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发表于 2015-4-29 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

先谢谢楼上的俩位老师.
有几点要补充:
1, 我提的一共有五个菌的总dna, 对其跑电泳后,发现除了一个总dna 带,下边还有俩条相临的,分子量较小的,比总dna带要亮的多的带,,,,rna,质粒,抑或断裂的总dna,??????
2,对他们进行pcr时,只有一个菌出现结果,其他的都显示空白,或是杂带.
请问是怎么一回是?
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发表于 2015-4-29 11:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果带型非常集中，用RNase消化不能去除，则有可能是质粒。
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发表于 2015-4-29 14:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你提取的总DNA是否与DNAmarker做过对照，大概是多大？至于那两个分子量小的带，建议你用抽提质粒的方法验证一下，是否就是质粒DNA。
另外，一般提取的细菌总DNA都是有断裂的，但如果引物没有问题，反应条件也合适的化，应该可以扩增出目的片段的，除非是你扩增的是大片段。
如果条件许可，尝试用试剂盒提取总DNA再做反应。
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xevin[使用道具]
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发表于 2015-4-29 14:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢。各位。
我现在pcr的结果已经做出来了。
问题我觉得，或是说总结以下有那么几点。
1，总dna的问题：提完之后，跑一下电泳，一般来说，只要有总dna带，其他的带不回对pcr造成影响。如果没有总dna带，嘿嘿，那就不好说了。
我的实验中的那两条杂带，的分子量大约在600-700bp吧。我老板说绝对不可能是质粒，因为他的量非常的大，即要比总dna带要亮的多。现在我怀疑是试剂被酶污染了。然后把dna酶切了。
2，就是在pcr时。摸板的量要尽量的少，适当的降低退火的温度，延长退火的时间。
就着些，算是经验吧。
再次谢谢各位。
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笑弯了腰[使用道具]
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发表于 2015-4-29 14:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

非常高兴你的结果出来了！
但是我认为问题并没有弄清楚：
首先，那两条很亮的带，染色体降解的结果应该是smear（非特异降解）或很多条带（较特异降解）。
其次，模板的量有个适当的范围。
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S6044[使用道具]
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发表于 2015-4-29 14:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是的，老师，你的这两个问题都对。
你的第一个问题，我现在也还没有搞明白，但既然结果已经出来了，我不想在这儿纠缠下去了。但是如那位有兴趣，我们可以讨论一下。
第二个问题，通常我们在加试剂的时候，都是根据参考书上加的，比如我就是根据分子可隆来做的。书上的数据一般来讲是要大于我们实验中的需要量，但是，我们在做实验是总是有一种心理，我不知道你们是不是这样的，但我是的，就是：总是怕试剂加少了，总觉的试剂加多了不回有坏处。
加少了有大麻烦。因而往往会。。。。。。
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