【求助】 PCR跑2.4kb片段求问

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标题:【求助】 PCR跑2.4kb片段求问

feima+[使用道具]
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发表于 2015-4-29 16:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的退火温度是65度5循环 63度5循环 60度5循环 58度25循环用的是KOD高保真酶延伸时间是3min marker是DL2000（2000,1000,750,500,250,100）第一空是其他引物跑的，当做内参，应该在700bp左右出片段第二孔是目的基因上的一对跨度200bp的引物跑的第三孔是目的条带上跨度2.4k的引物跑的第四孔是水做空白对照。请大家看看2.4k的到底有没有，问题出在哪，如何改进。用的是25ul体系，cDNA加了1ul。（PS：原来用2.4k的引物和另外的那条跨度700bp的引物在退火温度58度时跑过一次，结果700的非常清楚，2.4k的出了很多杂带，不过2.4k位置上还是看得到条带的。用的是25ul体系 cDNA加了2ul）。

附件

2015-4-29 16:08

201112311810.jpg (36.31 KB)

68943512yao[使用道具]
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发表于 2015-4-29 16:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

看不到条带，要优化条件了

newway[使用道具]
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发表于 2015-4-29 16:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

很明显，楼主要的2.4kb的条带没有！如果在58度是得到了条带，但有杂带，可以对模板进行一下纯度检测。另外楼主的体系应该优化，延伸时间有点长吧！跑一下梯度PCR。

xue258[使用道具]
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发表于 2015-4-29 16:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

58°如果有2.4k的条带，将其胶回收，用胶回收产物再做一次PCR试试

dior[使用道具]
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发表于 2015-4-29 16:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

做个梯度PCR 找最优的退火温度

feima+[使用道具]
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发表于 2015-4-29 16:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 xue258 于 2015-4-29 16:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

58°如果有2.4k的条带，将其胶回收，用胶回收产物再做一次PCR试试

关于这个问题我问过别人其认为这样子的条带扩增出来后送测序往往是错的尤其是中间部分，故建议就算是要做二次PCR 最好是条带虽淡但无杂带的情况。不知您的经验如何？谢谢

feima+[使用道具]
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发表于 2015-4-29 16:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 dior 于 2015-4-29 16:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
做个梯度PCR 找最优的退火温度

恕我愚昧我做的“退火温度是65度5循环 63度5循环 60度5循环 58度25循环”这不是梯度吗？几个概念我有点混淆：“降落PCR” “降温PCR"还听说过“升温PCR” 以及“跑个梯度” 请大虾帮我扫扫盲。另外请教：降温PCR 和升温PCR各自的特点，谢谢！（我跑的方案应该算降温PCR吧？）谢谢大家~

tudou85[使用道具]
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发表于 2015-4-29 16:14 资料个人空间短消息加为好友

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原帖由 feima+ 于 2015-4-29 16:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

恕我愚昧我做的“退火温度是65度5循环 63度5循环 60度5循环 58度25循环”这不是梯度吗？几个概念我有点混淆：“降落PCR” “降温PCR"还听说过“升温PCR” 以及“跑个梯度” 请大虾帮我扫扫盲。另外请教：降温PCR 和升温 ...

梯度PCR不是固定的循环数，然后退火温度设一个区间，比如52—60度，跑PCR么，其余的条件都相同，变量只有退火温度。楼主这个不是梯度PCR吧。还有，楼主2.4Kb的片段的引物是自己设计的吗？在扩增长片段的时候，设计的引物可能会在片段上有好多错配，可能出现好多条带，楼主说的好几条带可能是这个原因吧。

feima+[使用道具]
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发表于 2015-4-29 16:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 tudou85 于 2015-4-29 16:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

梯度PCR不是固定的循环数，然后退火温度设一个区间，比如52—60度，跑PCR么，其余的条件都相同，变量只有退火温度。楼主这个不是梯度PCR吧。还有，楼主2.4Kb的片段的引物是自己设计的吗？在扩增长片段的时候，设计的引物可能会在片 ...

谢谢您是说：比如我设的循环是30次梯度PCR的话我要在比如52度跑30个循环这样做一支EP管再做一支比如55度跑30个循环的.。。。。。。最后是60度跑30个循环的一支EP管那岂不要做好几次PCR 一次PCR要是跑2小时的话那要做好久啊........

另外关于引物的问题我很受启发引物是我设计的确实存在错配的情况可是这无法避免啊我想提高退火温度或许可以解决这个问题您说呢？谢谢！

tudou85[使用道具]
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发表于 2015-4-29 16:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 feima+ 于 2015-4-29 16:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢您是说：比如我设的循环是30次梯度PCR的话我要在比如52度跑30个循环这样做一支EP管再做一支比如55度跑30个循环的.。。。。。。最后是60度跑30个循环的一支EP管那岂不要做好几次PCR 一次PCR要是跑2小时的话 ...

你可以看看你用的PCR仪可不可以设梯度，大部分的PCR仪都是可以设梯度的。就是八个孔从前到后的温度是不一样的，你设定一个范围，就会分配各个孔的温度。我们这边每个孔的温度是机器随机分配的。只要做一次就可以了，摸退火温度的时候经常需要这么做的。
提高退火温度应该可以避免吧，不过长片段扩增的引物就是中间错配比较麻烦，希望你可以顺利解决~

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