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标题:【求助】PCR及测序问题

moonlight45[使用道具]
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发表于 2015-4-30 14:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】PCR及测序问题

大家好！最近我克隆了一个基因，但是测序结果比我的基因多出来一段44bp的序列，这一段44bp的序列几乎和我的引物一致，详细情况请见下面的alignment（EPHB3为GenBank里的序列，黄色部分为多出来的序列，红色部分为突变碱基，绿色部分为我的特异性引物）

不知多出来的序列是怎么来的，我想可能是用试剂盒做pcr纯化时未纯化干净，有引物残留，导致具有平末端连接活性的T4连接酶将引物连接到载体上了。可是PCR产物纯化试剂盒对50bp一下的片段没有回收能力，所以这个原因也不成立。    请教各位高手，看你们有好的解释没有~~谢谢大家了~~~


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2015-4-30 14:08
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xevin[使用道具]
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发表于 2015-4-30 14:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

想问下，你PCR后有做过酶切吗？酶切位点是否在你的引物和目的基因之间。如果没有做过酶切处理的话，你的PCR产物两端必然带有你的引物序列的
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发表于 2015-4-30 14:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，是这样的，我是用我的特异性引物P的EPHB3这个基因，然后做了PCR产物纯化，然后连接到pMD19T载体上，再转化，提质粒，酶切验证，然后再送测序的。如果正常的话，测出来的序列除去载体外是要和GenBank里的相同或者只有几个碱基突变不一致的。可是我的实际结果是测出来的序列与GenBank里做alignment，多出来黄色那一段，不知什么原因~
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发表于 2015-4-30 14:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 xevin 于 2015-4-30 14:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

想问下，你PCR后有做过酶切吗？酶切位点是否在你的引物和目的基因之间。如果没有做过酶切处理的话，你的PCR产物两端必然带有你的引物序列的

转化后还做了菌落PCR，挑选阳性克隆提质粒，酶切验证，然后再送质粒测序的~
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发表于 2015-4-30 14:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我提质粒前还做了菌落PCR挑选阳性克隆，送的未酶切的质粒测序。
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发表于 2015-4-30 14:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是挺奇怪的呀，你测序P的时候引物一条是载体上的，一条是你的特异性引物吧？还有，载体上没有与你目标条带同源的序列吧？
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发表于 2015-4-30 14:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 zzzz 于 2015-4-30 14:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
是挺奇怪的呀，你测序P的时候引物一条是载体上的，一条是你的特异性引物吧？还有，载体上没有与你目标条带同源的序列吧？

你好，不是的，我用的载体通用引物测序的，测序出来900多bp，我已经通过alignment把载体序列去掉，贴上来的这一部分是我克隆的序列，克隆的序列的前后绿色部分是我的特异性引物。我做了alignment，载体上没有和目标序列同源的~~谢谢~~
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发表于 2015-4-30 14:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
lz的意思看懂了。。。。
我觉得lz可以去看下正反向引物间是否容易形成二聚体。
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发表于 2015-4-30 14:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
呵呵  我测序经常出来这样的情况啊  前边多出来那些是引物部分
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hyuu[使用道具]
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 小中大
我记得用基因重组法克隆质粒上面是有GATEWAY引物序列的
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