小中大问题1：你师兄说的没错，但是根据我的理解，他的说法不适用于你的实验。事实上你对于标准曲线有个误会。就是标准曲线是用来干什么的。标准曲线主要是两个作用，第一是测定反应效率，就像我说的，理论上，任何样品稀释十倍，目的基因CT差距为3.3个循环，通过连续稀释多个梯度，如果你的样品反应效率为100%，各个稀释梯度之间CT差值是3.3，但事实上实际运行中这个很难做到，软件会根据你各个稀释梯度之间CT的差值和理论差值3.3之间的差异来计算出PCR运行中你的目的基因实际反应效率。进而对定量的结果做一个修正。第二个作用，是做绝对定量，就是在已经知道用来绘制标准曲线的样品中目的基因实际拷贝数的情况下，比如说使用质粒通过核酸定量仪来计算质粒浓度，进而推算质粒拷贝数，然后分为十倍梯度稀释根据一个稀释度3.3CT差距来绘制标准曲线，进而根据你的未知拷贝数待测样品在已知拷贝数标准曲线上所处的位置来推算出你的待测样品中目的基因的绝对拷贝数量。根据我的理解，你实验要测定的是反应效率，而不是绝对拷贝数。所以你要使用cDNA来做标准曲线，而不是质粒。
第二个问题，你的想法是对的。
第三个问题，双标准曲线还是多标准曲线取决于你要测定多少个基因的标准曲线，如果你测得只有目的基因和对照基因两个的，那就两个基因各自绘制一条标准曲线来看反应效率，如果你有多个测定的目的基因，那就是每个目的基因加上你的内参基因都绘制一个标准曲线来测定反应效率。
第四个问题，事实上为了保证试验中获得 完全纯度的RNA，我采用的是提取两次RNA,第一遍用普通的TRIZOL提取，纯化后获得RNA使用DNase处理，然后把这个样品使用TRIZOL LS(专门从液体样品中提取RNA的另一种TRIZOL试剂)重新提取一边，来保证我的RNA样品是高纯度的样品，无DNA残留，无杂蛋白和DNase残留。事实上，提取RNA做qPCR最讨厌的一步就在DNase处理上，不处理的话，基因组DNA污染会影响你的结果，处理的话，RNA样品中残留的DNase会很严重的影响反转录产物，进而影响结果。事实上，无论哪个DNase处理试剂盒，都不能保证RNA中无DNase残留，对这个，我有切身体会。所以我的解决办法就是提取两次RNA.虽然很麻烦，但是可以保证结果。
