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标题:【求助】PCR扩增只出了一个清晰条带，但短于目的条带100bp

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发表于 2015-5-4 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】PCR扩增只出了一个清晰条带，但短于目的条带100bp


扩增的是至少972bp的条带，为什么跑胶之后，条带在800-900之间？30个cycle。做了四个温度。都是这个情况。没有杂带，条带很清楚。如果不是对于大小有疑问，就认为是PCR成功了。模板来源是肺癌细胞A549里反转出的cDNA。谢谢各位大神！
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发表于 2015-5-4 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征46XX性发育睾丸疾病
primer blast的结果：Primer pair 1
Sequence (5'->3')        Template strand        Length        Start        Stop        Tm        GC%        Self complementarity        Self 3' complementarity
Forward primer        ATGGCGGAGAAGTTTGACT        Plus        19        1        19        56.65        47.37        3.00        3.00
Reverse primer        TCACGGAGCATTTTTTGCAG        Minus        20        972        953        57.58        45.00        4.00        2.00
Product length        972
Products on potentially unintended templates
>XM_006724747.1 PREDICTED: Homo sapiens four and a half LIM domains 1 (FHL1), transcript variant X5, mRNAproduct length = 772Forward primer 1 ATGGCGGAGAAGTTTGACT 19Template 85 ................... 103Reverse primer 1 TCACGGAGCATTTTTTGCAG 20Template 856 .................... 837>XM_006724746.1 PREDICTED: Homo sapiens four and a half LIM domains 1 (FHL1), transcript variant X4, mRNAproduct length = 972Forward primer 1 ATGGCGGAGAAGTTTGACT 19Template 85 ................... 103Reverse primer 1 TCACGGAGCATTTTTTGCAG 20Template 1056 .................... 1037>XM_006724745.1 PREDICTED: Homo sapiens four and a half LIM domains 1 (FHL1), transcript variant X3, mRNAproduct length = 972Forward primer 1 ATGGCGGAGAAGTTTGACT 19Template 167 ................... 185Reverse primer 1 TCACGGAGCATTTTTTGCAG 20Template 1138 .................... 1119>XM_006724744.1 PREDICTED: Homo sapiens four and a half LIM domains 1 (FHL1), transcript variant X2, mRNAproduct length = 972Forward primer 1 ATGGCGGAGAAGTTTGACT 19Template 212 ................... 230Reverse primer 1 TCACGGAGCATTTTTTGCAG 20Template 1183 .................... 1164>XM_006724743.1 PREDICTED: Homo sapiens four and a half LIM domains 1 (FHL1), transcript variant X1, mRNAproduct length = 972Forward primer 1 ATGGCGGAGAAGTTTGACT 19Template 134 ................... 152Reverse primer 1 TCACGGAGCATTTTTTGCAG 20Template 1105 .................... 1086>NM_001159702.2 Homo sapiens four and a half LIM domains 1 (FHL1), transcript variant 1, mRNAproduct length = 972Forward primer 1 ATGGCGGAGAAGTTTGACT 19Template 330 ................... 348Reverse primer 1 TCACGGAGCATTTTTTGCAG 20Template 1301 .................... 1282>NM_001167819.1 Homo sapiens four and a half LIM domains 1 (FHL1), transcript variant 9, mRNAproduct length = 772Forward primer 1 ATGGCGGAGAAGTTTGACT 19Template 198 ................... 216Reverse primer 1 TCACGGAGCATTTTTTGCAG 20Template 969 .................... 950>NM_001159703.1 Homo sapiens four and a half LIM domains 1 (FHL1), transcript variant 6, mRNAproduct length = 585Forward primer 1 ATGGCGGAGAAGTTTGACT 19Template 330 ................... 348Reverse primer 1 TCACGGAGCATTTTTTGCAG 20Template 914 .................... 895>NM_001159704.1 Homo sapiens four and a half LIM domains 1 (FHL1), transcript variant 4, mRNAproduct length = 772Forward primer 1 ATGGCGGAGAAGTTTGACT 19Template 712 ................... 730Reverse primer 1 TCACGGAGCATTTTTTGCAG 20Template 1483 .................... 1464>NM_001159701.1 Homo sapiens four and a half LIM domains 1 (FHL1), transcript variant 5, mRNAproduct length = 772Forward primer 1 ATGGCGGAGAAGTTTGACT 19Template 137 ................... 155Reverse primer 1 TCACGGAGCATTTTTTGCAG 20Template 908 .................... 889>NM_001159700.1 Homo sapiens four and a half LIM domains 1 (FHL1), transcript variant 3, mRNAproduct length = 772Forward primer 1 ATGGCGGAGAAGTTTGACT 19Template 261 ................... 279Reverse primer 1 TCACGGAGCATTTTTTGCAG 20Template 1032 .................... 1013>NM_001159699.1 Homo sapiens four and a half LIM domains 1 (FHL1), transcript variant 7, mRNAproduct length = 772Forward primer 1 ATGGCGGAGAAGTTTGACT 19Template 266 ................... 284Reverse primer 1 TCACGGAGCATTTTTTGCAG 20Template 1037 .................... 1018>NM_001449.4 Homo sapiens four and a half LIM domains 1 (FHL1), transcript variant 2, mRNAproduct length = 772Forward primer 1 ATGGCGGAGAAGTTTGACT 19Template 330 ................... 348Reverse primer 1 TCACGGAGCATTTTTTGCAG 20Template 1101 .................... 1082
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发表于 2015-5-4 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Products on potentially unintended templates
>XM_006724747.1 PREDICTED: Homo sapiens four and a half LIM domains 1 (FHL1), transcript variant X5, mRNAproduct length = 772Forward primer 1 ATGGCGGAGAAGTTTGACT 19Template 85 ................... 103Reverse primer 1 TCACGGAGCATTTTTTGCAG 20Template 856 .................... 837
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发表于 2015-5-4 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

照你这样说，好像是没什么问题，条带清晰，又无杂带，那这样可以考虑一下胶的原因，可能是胶浓度或者是胶放置久了的原因
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发表于 2015-5-4 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

测一下序吧！跑的胶测这么大的片段不一定准，有很多因素会影响跑的速度。
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发表于 2015-5-4 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

测序。也许是Alternative Splicing产物。
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发表于 2015-5-4 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个基因有9个transcript variants 5个isoform。
用prime BLAST得到的结果，大都是772或者972bp，其一如下：
>NM_001159701.1 Homo sapiens four and a half LIM domains 1 (FHL1), transcript variant 5, mRNAproduct length = 772
Forward primer 1 ATGGCGGAGAAGTTTGACT 19Template 137 ................... 155
Reverse primer 1 TCACGGAGCATTTTTTGCAG 20Template 908 .................... 889
可是我去查variant5的CDS不止772bp。
但我送测序之后的结果，
能跟variant2,3,4,9对上772bp
能跟variant5对上776bp
能跟variant7对上776bp
但是似乎都比这些variant要短。也就是说我没有得到任何一个variant？
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发表于 2015-5-4 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我同样的设计引物要避开保守结构域。
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发表于 2015-5-4 17:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 october7 于 2015-5-4 17:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我同样的设计引物要避开保守结构域。

但是我们老师叫我们设计引物的时候，就是找到CDS，然后在上下游直接用配对的碱基（中间还调一调Tm，二级结构之类的）设计引物。
那重新设计吗？重新设计怎么设计呢？克隆出来的就不止是全长了。
我还怀疑是不是肿瘤细胞里没有这个variant1 所以克隆不出来。我想换个正常的细胞，但是实验室好像没有，可能只有293T细胞系。。。
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发表于 2015-5-4 17:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.电泳的精密度没有想像的高，可以跑一个agilent 2100电泳，试试。
2.有很多splice;下面是我比对的结果
3.建议割胶回收后，拿去测序。返回测序结果再来讨论，反正测序便宜的很。
>uc004ezo.3__FHL1:330+1301 972bp ATGGCGGAGAAGTTTGACT TCACGGAGCATTTTTTGCAGATGGCGGAGAAGTTTGACTgccactactgcagggatcccttgcaggggaagaagtatgtgcaaaaggatggccaccactgctgcctgaaatgctttgacaagttctgtgccaacacctgtgtggaatgccgcaagcccatcggtgcggactccaaggaggtgcactataagaaccgcttctggcatgacacctgcttccgctgtgccaagtgccttcaccccttggccaatgagacctttgtggccaaggacaacaagatcctgtgcaacaagtgcaccactcgggaggactcccccaagtgcaaggggtgcttcaaggccattgtggcaggagatcaaaacgtggagtacaaggggaccgtctggcacaaagactgcttcacctgtagtaactgcaagcaagtcatcgggactggaagcttcttccctaaaggggaggacttctactgcgtgacttgccatgagaccaagtttgccaagcattgcgtgaagtgcaacaaggccatcacatctggaggaatcacttaccaggatcagccctggcatgccgattgctttgtgtgtgttacctgctctaagaagctggctgggcagcgtttcaccgctgtggaggaccagtattactgcgtggattgctacaagaactttgtggccaagaagtgtgctggatgcaagaaccccatcactgggaaaaggactgtgtcaagagtgagccacccagtctctaaagctaggaagcccccagtgtgccacgggaaacgcttgcctctcaccctgtttcccagcgccaacctccggggcaggcatccgggtggagagaggacttgtccctcgtgggtggtggttctttatagaaaaaatcgaagcttagcagctcctcgaggcccgggtttggtaaaggctccagtgtggtggcctatgaaggacaatcctggcacgactactgcttccaCTGCAAAAAATGCTCCGTGA
>uc004ezq.2__FHL1:330+914 585bp ATGGCGGAGAAGTTTGACT TCACGGAGCATTTTTTGCAGATGGCGGAGAAGTTTGACTgccactactgcagggatcccttgcaggggaagaagtatgtgcaaaaggatggccaccactgctgcctgaaatgctttgacaagttctgtgccaacacctgtgtggaatgccgcaagcccatcggtgcggactccaaggaggtgcactataagaaccgcttctggcatgacacctgcttccgctgtgccaagtgccttcaccccttggccaatgagacctttgtggccaaggacaacaagatcctgtgcaacaagtgcaccactcgggaggactcccccaagtgcaaggggtgcttcaaggccattgtggcaggagatcaaaacgtggagtacaaggggaccgtctggcacaaagactgcttcacctgtagtaactgcaagcaagtcatcgggactggaagcttcttccctaaaggggaggacttctactgcgtgacttgccatgagaccaagtttgccaagcattgcgtgaagtgcaacaagggtttggtaaaggctccagtgtggtggcctatgaaggacaatcctggcacgactactgcttccaCTGCAAAAAATGCTCCGTGA
>uc011mwb.1__FHL1:266+973 708bp ATGGCGGAGAAGTTTGACT TCACGGAGCATTTTTTGCAGATGGCGGAGAAGTTTGACTgccactactgcagggatcccttgcaggggaagaagtatgtgcaaaaggatggccaccactgctgcctgaaatgctttgacaagttctgtgccaacacctgtgtggaatgccgcaagcccatcggtgcggactccaaggaggtgcactataagaaccgcttctggcatgacacctgcttccgctgtgccaatgcaccactcgggaggactcccccaagtgcaaggggtgcttcaaggccattgtggcaggagatcaaaacgtggagtacaaggggaccgtctggcacaaagactgcttcacctgtagtaactgcaagcaagtcatcgggactggaagcttcttccctaaaggggaggacttctactgcgtgacttgccatgagaccaagtttgccaagcattgcgtgaagtgcaacaaggccatcacatctggaggaatcacttaccaggatcagccctggcatgccgattgctttgtgtgtgttacctgctctaagaagctggctgggcagcgtttcaccgctgtggaggaccagtattactgcgtggattgctacaagaactttgtggccaagaagtgtgctggatgcaagaaccccatcactgggtttggtaaaggctccagtgtggtggcctatgaaggacaatcctggcacgactactgcttccaCTGCAAAAAATGCTCCGTGA
>uc022ceu.1__FHL1:198+969 772bp ATGGCGGAGAAGTTTGACT TCACGGAGCATTTTTTGCAGATGGCGGAGAAGTTTGACTgccactactgcagggatcccttgcaggggaagaagtatgtgcaaaaggatggccaccactgctgcctgaaatgctttgacaagttctgtgccaacacctgtgtggaatgccgcaagcccatcggtgcggactccaaggaggtgcactataagaaccgcttctggcatgacacctgcttccgctgtgccaagtgccttcaccccttggccaatgagacctttgtggccaaggacaacaagatcctgtgcaacaagtgcaccactcgggaggactcccccaagtgcaaggggtgcttcaaggccattgtggcaggagatcaaaacgtggagtacaaggggaccgtctggcacaaagactgcttcacctgtagtaactgcaagcaagtcatcgggactggaagcttcttccctaaaggggaggacttctactgcgtgacttgccatgagaccaagtttgccaagcattgcgtgaagtgcaacaaggccatcacatctggaggaatcacttaccaggatcagccctggcatgccgattgctttgtgtgtgttacctgctctaagaagctggctgggcagcgtttcaccgctgtggaggaccagtattactgcgtggattgctacaagaactttgtggccaagaagtgtgctggatgcaagaaccccatcactgggtttggtaaaggctccagtgtggtggcctatgaaggacaatcctggcacgactactgcttccaCTGCAAAAAATGCTCCGTGA
>uc004ezm.2__FHL1:330+731 402bp ATGGCGGAGAAGTTTGACT TCACGGAGCATTTTTTGCAGATGGCGGAGAAGTTTGACTgccactactgcagggatcccttgcaggggaagaagtatgtgcaaaaggatggccaccactgctgcctgaaatgctttgacaatttgccaagcattgcgtgaagtgcaacaaggccatcacatctggaggaatcacttaccaggatcagccctggcatgccgattgctttgtgtgtgttacctgctctaagaagctggctgggcagcgtttcaccgctgtggaggaccagtattactgcgtggattgctacaagaactttgtggccaagaagtgtgctggatgcaagaaccccatcactgggtttggtaaaggctccagtgtggtggcctatgaaggacaatcctggcacgactactgcttccaCTGCAAAAAATGCTCCGTGA
>uc011mvy.1__FHL1:261+1032 772bp ATGGCGGAGAAGTTTGACT TCACGGAGCATTTTTTGCAGATGGCGGAGAAGTTTGACTgccactactgcagggatcccttgcaggggaagaagtatgtgcaaaaggatggccaccactgctgcctgaaatgctttgacaagttctgtgccaacacctgtgtggaatgccgcaagcccatcggtgcggactccaaggaggtgcactataagaaccgcttctggcatgacacctgcttccgctgtgccaagtgccttcaccccttggccaatgagacctttgtggccaaggacaacaagatcctgtgcaacaagtgcaccactcgggaggactcccccaagtgcaaggggtgcttcaaggccattgtggcaggagatcaaaacgtggagtacaaggggaccgtctggcacaaagactgcttcacctgtagtaactgcaagcaagtcatcgggactggaagcttcttccctaaaggggaggacttctactgcgtgacttgccatgagaccaagtttgccaagcattgcgtgaagtgcaacaaggccatcacatctggaggaatcacttaccaggatcagccctggcatgccgattgctttgtgtgtgttacctgctctaagaagctggctgggcagcgtttcaccgctgtggaggaccagtattactgcgtggattgctacaagaactttgtggccaagaagtgtgctggatgcaagaaccccatcactgggtttggtaaaggctccagtgtggtggcctatgaaggacaatcctggcacgactactgcttccaCTGCAAAAAATGCTCCGTGA
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