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标题:【求助】 请问关于稳定细胞株所用载体问题

eric930[使用道具]
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发表于 2015-5-6 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】 请问关于稳定细胞株所用载体问题


你好，请问关于稳定细胞株所用载体问题：
1、现在GS载体是否具有比DHFR有优势，相关专利大约什么时候到期？
2、稳定细胞株在使用过程中的产量衰减问题是如何解决的，用大量的稳定细胞株长期加压筛选？
3、如果采用定点整合载体，如何选择？
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eric930[使用道具]
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发表于 2015-5-6 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1、现在GS载体是否具有比DHFR有优势，相关专利大约什么时候到期？
GS相对DHFR而言具有以下几点优势：
1，细胞株筛选时间短，不需要不断的加压筛选。
2，在细胞株稳定性问题上，GS系统要更加稳定，一般稳定性培养都要做到3个月左右时间。
GS的专利好像还没有到期，DHFR的专利到期了。现在的筛选系统趋向于GS和DHFR双筛选系统，目的是集合两种优点，但效果还不确定。
2、稳定细胞株在使用过程中的产量衰减问题是如何解决的，用大量的稳定细胞株长期加压筛选？
细胞株克隆不稳定主要是克隆选择不好或筛选系统不好，主要偏向于前者。细胞株稳定性一般培养到两个月以后降低15%左右还是可以接受的
3、如果采用定点整合载体，如何选择？
这种方法目前常规用的可能比较少，在这方面没有经验的。一般GS或DHFR系统筛选到高表达细胞株克隆的概率是5%左右.
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发表于 2015-5-6 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对于一个全新的CHO细胞株（公司引进），我想开发一种适合它的培养基，目前准备对几种常见的成分已知的培养基进行不同混合，然后再进行优化，筛选出最佳方案。还有一种策略就是选择目前市场上的一些商业化培养基进行筛选，前面一种方法肯定更费时费力，但是感觉优化的空间更大点，不知您的意见如何？还是有其他更好的筛选方法，谢谢！

您的问题非常具有代表性。就中小生物技术公司而言，对于重组蛋白药物开发的介入，往往是从获得稳定细胞系开始的。针对这种情况，笔者的个人建议是这样：
1、首先应了解该细胞系的来源、背景。即宿主细胞的生长特性、重组细胞的构建流程。培养基的开发虽然可大幅提高表达水平。但是细胞系的营养需求、生产能力在细胞构建的过程中就已经决定了。这是一个“先天”和“后天”的关系。而且，宿主的营养需求、载体的抗性标记，以及细胞系生产能力与遗传稳定性，这些细节都能为后续培养基开发工作提供依据和思路。
2、一般项目交接时，技术方会提供与细胞系配套的培养基。培养基若为对方定制产品，则很可能此该培养基已经是针对细胞系优化后的“个性化培养基”；如果培养基为商品化的通用型培养。则表明培养基尚有继续开发的潜力和必要。
此时建议你两种策略：1）直接在培养基中添加营养成分（如水解物、IGF、INSULIN等），如liuzy1974所言，水解物是成本低廉、效果显著的营养添加物。2）针对该细胞系对市售成熟的培养基进行筛选（不推荐厂商，可直接google到）。这部分试验，在三角瓶中批式培养即可看出差异。若其中最优培养尚未达到优化效果。可考虑不同培养基进行混合试验。为减少试验次数、提高试验效率，可使用DOE软件进行试验方案设计。
3、如果您有已知配方的一种或多种动物细胞培养。可在此基础上进行系统开发。参阅文章中的方法，可以针对特定细胞系开发其“个性化培养基”，也可以开发供多个细胞系共同使用的“平台化培养基”。
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eric930[使用道具]
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发表于 2015-5-6 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有一个问题请教各位，在国内的实际生产中，提高抗体产量、改善抗体质量更主要是依赖工艺优化呢，还是寄希望于细胞株、培养基的改良？或者更直白一点，药厂老总更青睐于手下人用哪种方式来优化抗体生产？
请大家不吝赐教
谈下自己的认识：楼主的问题很具代表性。无论是做biosimilar，还是其他重组蛋白药。大家最关心的是往往是三个方面, 蛋白表达量（title）、质量（quality），还有就是进度。
1、Title，细胞培养过程中蛋白的表达量是由单个细胞的产物比生产速率（Qp），活细胞密度（IVCD）以及培养时间（Time）三者决定的。即 Title=Qp*IVCD*Time
Qp代表的是细胞异源表达重组蛋白的能力，它是细胞系构建过程中初筛、复筛的主要技术指标。目前行业内能够用于产业化生产的细胞系，Qp一般可以达到20pg/cell/day以上。 构建的细胞是否能够达到这个水平，一般取决与空宿主、载体、筛选通量，筛选策略。
IVCD活细胞密度和Time培养时间，一般是初筛得到的重组细胞进行培养基优化、工艺开发时，主要考察的指标。目前行业内细胞使用商品化的培养基（Gibico/hyclone等）悬浮细胞密度一般可达1-3*10E7/ml，生长期5-7day，维持期10day以上。此步为细胞培养的工艺开发，需要借助三角瓶、深度孔板、小型反应器等进行培养基筛选、工艺参数优化。
所以，细胞的表达能力一般是细胞系构建工程中就已经决定了。而细胞的培养密度、培养周期则需要在培养工艺开发中进行优化。两者都做好了，抗体的产量自然就有了保证。
接着谈下质量。
抗体作为四聚体糖蛋白，其生物学活性有赖于其完整的结构和恰当的翻译后修饰。某种角度上说，重组抗体的工艺优化，尤其是做similar，质量比TITER更为重要。
目前重组抗体的制备是采用动物细胞异源表达。其制备工艺中无论是克隆筛选、细胞培养还是纯化工艺都会都抗体的质量造成影响。克隆筛选的常用策略是根据蛋白表达量去挑选高表达克隆。这样就会造成表达水平高、但是存在质量变异的克隆会进入下一轮复筛。但是，在克隆筛选环节考察产物的质量，需要借助高通量的分析设备。细胞培养过程中无论是培养基、培养工艺（PH/DO/TIME），甚至搅拌桨的设计都会影响抗体的质量。另外，纯化、制剂过程中，涉及到的buffer条件不恰当也会造成蛋白聚体的产生。
目前重组抗体工艺开发中，经常关注的几个质量指标有
1、分子量，
2、纯度，即，单体、大分子物质（聚体）、小分量物质（降解）的含量
3、糖基化修饰（寡糖类型及分布，如GO/G1F/G2F/MAN5等
4、等电点。
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eric930[使用道具]
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发表于 2015-5-6 17:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
小弟最近在做电荷异构体相关研究 ，大家都知道希望自己的样品更加呈均一性，减少电荷异构体。尤其在做BIOSIMILAR..更加需要对这些参数进行控制，趋向于和原研药一致。 但一个控制范围的把握是很重要的，我想要了解下电荷异构体对质量的影响，比如说药效，免疫原性方面的，本人已经找了很久，请教各位是否有看到类似文章？不甚感激
1、抗体分子的异质性与电荷变异
抗体分子作为复杂的四聚体糖蛋白，具有质量不均一的特点，即“异质性"。异质性可能来自于抗体分子复杂的生物合成途径，（如细胞系及培养工艺影响糖基化）也可能来于纯化，制剂工艺中产生降解或聚体。
这种异质性也可以宏观表现为：在等电聚焦电泳图上出现弥散或多个条带；离子交换色谱图主峰前后出现小峰。这是由于抗体分子所带电荷差异造成的异质性，所以，这种现象也被称为抗体的电荷变异。
2、抗体电荷变异对其药效学的影响
目前普遍认为抗体电荷变异对其药效学影响并不显著。基因泰克公司曾对上市抗体及临床前抗体药物做过一个总结。得出的结论是：1）当电荷变异超过一个pH单位时，会影响药物的组织分布及药代动力学。2）增加正电荷，会提高药物的组织停滞，降低血液清除。3）降低正电荷，会减少药物的组织停滞，提高药物的全身清除。（Effects of Charge on Antibody Tissue Distribution and Pharmacokinetics ，见附件）
3、影响电荷变异的因素及避免方法
目前的研究发现：多种化学修饰都会引起重组抗体等电点的改变，如：
脱酰胺化、唾液酸化、重链C段赖氨酸清除会造成重组抗体的带正电荷；
赖氨酸/甘氨酸酰胺化反应、甲硫氨酸氧化作用等会造成重组抗体带负电荷[85]。
针对细胞培养环节，提高培养基中Cu2+浓度，降低Zn2+浓度，可以增强重组抗体C端脯氨酸的酰胺化，最终导致重组抗体发生碱性电荷变异。[86][87]
4、参考文献
[85] Khawli LA, Goswami S, Hutchinson R, et al. Charge variants inigg1: Isolation, characterization, in vitro binding properties and pharmacokinetics in rats. MAbs, 2010, 2(6): 613-624
[86] Kaschak T, Boyd D, Lu F, et al. Characterization of the basiccharge variants of a human igg1: Effect of copper concentration in cell culturemedia. MAbs, 2011, 3(6): 577-583
[87] Luo J, Zhang J, Ren D, et al. Probing of c-terminal lysinevariation in a recombinant monoclonal antibody production using chinese hamsterovary cells with chemically defined media. Biotechnology and bioengineering,2012, 109(9): 2306-2315
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 小中大

您好！有个问题请教一下，抗体药物在研发、细胞构建、小试、中试、临床这些阶段需要关注哪些法律法规？希望能些好的建议，万分感谢！

一直以为，熟悉、掌握生物制药开发的相关政策法规，应该是从事此方面研究的技术人员应具备的基本素质。但是，受精力、专业知识所限，自已也没有进行过系统的学习。所以单独开贴，将自己学习的体会附上。也请战友结合业内的案例分析，探讨下这些政策法规的意义，要求。
主要的指导原则见国家药审中心网站（但是并不全）
cuturl('http://www.cde.org.cn/zdyz.do?method=initValue&frameStr=0#top')
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eric930[使用道具]
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发表于 2015-5-6 17:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
（2）主细胞库(MCB)
取原始细胞库细胞，通过一定方式进行传代、增殖后均匀混合成一批，定量分装，保存于液氮或-130℃以下。这些细胞必须按其特定的质控要求进行全面检定，应合格。主细胞库用于工作细胞的制备，每个生产企业的主细胞库最多不得超过两个细胞代次。
——生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程

刚才看了《一般指导原则》其中提到（……基质制备及检定规程），里面这句话不是很理解的。能帮忙解释一下吗？
谢谢！
问题多么的“似曾相识”啊！呵呵，工作中也曾和同事讨论过这个问题。谈下个人看法：
1、主细胞库为什么会出现两个细胞代次？
一般情况下，重组细胞株构建及建库的过程中。原始细胞株通常要保存十余只冻存管。主细胞库通常保存数十只冻存管。工作细胞库会保存数百只冻存管。根据经验，每只冻存管中细胞总数约1.5-2×10E7cell。
如果，细胞传代到某一代次，所有的细胞总数不能满足冻存需要（1.5-2×10E7cell/只 ×主细胞库冻存管数）。则可能合并两个代次的细胞，构建主细胞库。
但是，根据工作经验，这种情况出现的几率太小了。因为上一代的细胞，都用作传代。即便是有用来“保种”的细胞，它也不能称之为上一代细胞。
除非，同时复苏了两只冻存管，一支传到N代次，一支传到N+1次。为满足主细胞库冻存细胞总数需要。合并两个代次的细胞。
2、主细胞库为什么不能超过两个代次？
目前用作宿主的动物细胞都具有“永生性”，如杂交瘤，CHO。但是，为保证重组细胞的遗传稳定性，无论种子细胞（主细胞库、工作细胞库）都有一个明确的代次限定。并且，要经过“遗传稳定性”试验证明，在上述代次范围内，细胞株的诸多表型（如蛋白质量，蛋白表达水平等）基本稳定，趋于一致。
目前已业内主流的悬浮细胞培养工艺，从一个冻存管，到发酵终点（20，000L反应器）细胞可能要扩增60-90代。为了保证终端产品的质量稳定性，最简单的办法就是，从细胞株源头保证种子细胞的一致性。所以，监管部门确定，主细胞库的细胞来源，最多不超过两个代次。
其实，业内都是普遍自觉的，使用一个代次的种子细胞构建主细胞库。
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