细胞世界

细胞洁净度的处理，我在DXY上看到过一位前辈曾说过，换液时可以可用PBS洗几遍，好像会少一些；我个人认为，死细胞是无法避免的，所以我们只能去尽可能的优化条件去减少死细胞的数量，而贴壁的死细胞可能与我们的培养条件有关，因为细胞是已经贴壁然后再死的（时间长了也会死的这个不算在内）。而整个心肌细胞培养的过程我觉得最关键的可能在于消化的控制，心脏剪碎和取心脏，因为这一方面决定了细胞的生长的状态和细胞活力，另一方面关乎细胞培养的结果可重复性，而在消化和取心脏过程中，我们应该尽可能的去注意条件和操作手法的控制（如消化时间，细胞冰浴，心脏取的大小等）。
对于台盼蓝细胞计数，我一般也是数的是大的圆的，但有一些也是大的，形状不规则的，有时数量还比较多，不知各位老师也是否计算在内，我一般是计算的。从我使用的protocol来看，我用的也是混合酶消化，但同样的操作条件下，优秀结果的重复性太差，每次细胞的频率和幅度也不完全一致，可能因为仪器是通过检测，所以能够较精确的比较每一次的结果差异性，跳动的频率有时60多次，有时90多次；同时间细胞的跳动幅度也不一致；且细胞起跳时间也不一致，有时24小时就跳的非常好，而有时48小时才跳的勉强接受。
不知各位老师对于心肌细胞原代培养有什么独特的好的想法，欢迎您提出来，我们大家共同讨论，三个臭皮匠顶一个诸葛亮嘛，祝每一次都能做出比较完美的结果，谢谢您！
......

===============================================================================================================

老师您好：我最近在学习做心肌细胞原代培养，但是出现了向您上述的细胞贴壁以后死亡的情况，就是我晃动培养液的时候，一些细胞就在培养液里飘动，而一些细胞明显是贴壁了，但是外圈变亮，核颜色较深，一看就是细胞已经死了。时间不长啊就是48小时贴壁以后，基本上一个视野下也就有十个不到的心肌细胞，但是有约有几百个死细胞，我觉得就是我已经将细胞消化下来了，但是在好像就是在培养液里不成活。也不知道是我消化下来的时间太长了么，还是培养基的成分不对，我用的血清不是CIBIC的，10%的FBS，DMEM高糖，1%的双抗。
另，您能把您的protocal给我发一份么？我用的是0.25%的胰酶直接消化的，我消化的是KM乳鼠，一次约消化十只，一次放不到2ml的胰酶，大约消化三十秒左右，一共约消化30-40次左右，根据胰酶的颜色来判断是不是消化到时间了！其他地方和园子里的其他兄弟姐妹们都差不多，就是酶的浓度比较大，而且我不用二型胶原酶，您帮我看看我哪里有问题啊！我都分了不下十次了，郁闷的要死，回头我给您上传一张照片您帮我看看啊！
谢谢您~

恩，没事，您忙完给我回复就好，有时间回复，没时间也没有关系啊！我就是想让您帮我分析一下，我的细胞就是不贴壁，或者贴壁了以后就是死亡的状态，您能帮我分析一下原因么？不知道是消化过了，还是消化的不够啊。我也是按照您的PROTOCAL做的，但是上次的结果还是不好，您说我可能是硬件上的问题么？比如孵箱，我做的是KM乳鼠，希望您多指教啊！

===============================================================================================================

我个人觉得这是可能是细胞被消化过度，其次是培养条件有问题，你在接种细胞前计数时用台盘蓝染色观察一下细胞活力，细胞是圆圆的非常透亮的，且反光性很好，这是细胞活力高的表现，若是这说明细胞是没有问题的；在此基础上检查一下血清，培养基和培养箱，看是否有存在问题，谢谢！

小鼠产量会低，不知道你用哪种酶消化，我消化过程始终没有出现絮状沉淀。如果你在第5次吹打，估计后面的细胞也都不多，因为吹打本来就可以将细胞吹散，只是机械损伤可能较大。我没有试过这样吹打，但一般出现明显的絮状物，在我看来，结果都不好。如果你一定要吹打，注意不要引起气泡。如果你絮状物没有彻底吹散，过筛肯定是困难的。
不知道你22只小鼠种了多大的面积？我12只小鼠大约能种6孔板中3-4个孔，成纤维生长旺盛加Brdu可有效改善。周围的人做小鼠心肌细胞不多，所以不知道较大的产量是多少。
不知道你的情况是不是类似，你种下去第二天看，细胞会呈一团一团地跳动吗？我的几次来看，小鼠心肌细胞头2-3天会抱团，一个集落一个集落地跳，3天后会慢慢铺开，表现为细胞团块越来越小，跳动的面积越来越大，到第4-5天时可以看到成片跳动，如果种的密度低，就很难看到成片跳动的景象，多是一个集落一个集落地跳。
......

============================================================

hello, 看了你的帖子，收获很多。
我也养C57小鼠心肌。20个可铺成12个孔。也能成片跳动。
请教你个问题：你是每天换液吗，还是第一天换一次，以后每48小时换一次？