小中大 3 "还有分到什么程度是用Sephadex LH20比较好?"
如果实验室Sephadex LH20很珍贵，分道较纯再用， 如果实验室Sephadex LH20很普及，只要满足使用的注意事项，较粗的样品可直接使用Sephadex LH20分离。日本的师兄都是用Sephadex LH20粗分，人家有钱，所以不在乎。如果硅胶比Sephadex LH20还贵，你一定先用Sephadex LH20粗分，再用硅胶吧。有很多问题根本不是学术本身的问题，人也不可能在真空中搞科研。哈哈，跑题了。
解答如下:
1 在分离过程中遇到要分离的样品量很大,而柱层填料相对较少的情况是很多的.一般解决的途径有两条:
1) 将样品一次全上柱,这样分离效果一定不会好,但我们的侧略是将样品交叠的部分再上一遍或几遍,这叫反复xxxx柱层，好处是工作量小(对比下面就知道了)，在前后较纯的馏分，如果目标组分量足够，可就乐去吧。
2 ) 将样品分几次分别分离，这样每次分离的效果一定比将样品一次全上柱的分离效果好，但这样有一个很大的弊病，就是每次柱层的条件不可能保持完全一至，这样几次柱层分离的馏分间的重现性就存在很大问题，再将几个分开上的柱层馏分合并的过程中，合的太粗，就如同 将样品一次全上柱的合并结果，只是工作量增大了。如果心中不甘，你中有我我中有你的馏分，我也不知怎么合并了。
所以推荐的做法是将样品一次全上柱，再通过反复柱层的方法来逐步提高分离效果，
唉呀，我嘴苯，不知有没有说清。
2 100g填料已不少了， astra兄的样品如果实在太多，就只好分开上柱了.
3 一般Sephadex LH20上样体积具体也没有明确的规定，在柱床体积的1/10吧。
谈一些个人想法
样品经过分离一般而言会产生两种结果 :
1 目标组分的相对纯度提高,因为经过分离后各组份分别在不同的馏分富集,当然在富集目标组分的馏分中目标组分的含量要比总样中的含量要高,所以我们说目标组分得以纯化.
2 目标组分的绝对量减少,因为无论是什么分离手段,物质的分离总会有交叉,意即不但目标组分分布于主要富集目标组分的馏分中,相邻馏分中也定会有它的踪影, 只是可能不是相邻馏分的主成分,从分离的角度,那些相邻馏分并非是我们想要的,我们只将目标组分的相对含量高的馏分用于下一步分离,这种结果必然是与原样相比用于下一步分离的馏分中目标组分的绝对量要少一些.
astra兄说"是指上柱前不纯，上柱后目标产物仍然不纯",我想其相对纯度是不是有所提高呢?
astra兄说"我感觉东西越弄越少",是不是可以理解了呢?
当然,我们希望的是成功的分离应该是"目标组分的相对纯度最大限度的提高,最大限度的避免目标组分绝对量的减少"
1 astra君提到用少量的甲醇/水-甲醇洗脱，但洗出的流份比较难处理,是指甲醇水难蒸干吗?其实这根本不应成为问题.astra君请想一想,做植化的, 哪有遇不到甲醇水的时候, ODS柱层用甲醇水洗脱, Sephadex LH20柱层用甲醇水洗脱,D101用乙醇水洗脱, HP20 用甲醇水洗脱, 高效液相最常用的是反相, 流动相还是甲醇水,可见甲醇水是植化同志最亲密的朋友! 所以蒸不干也要蒸,想想办法吗!
2 .像水这种高沸点的溶剂是很难蒸干的,,办法是有的,先看看旋转薄膜的几个要素: 真空度, 冷凝液, 蒸发温度.
1) 真空度决定于水泵的效率和系统的密闭性.一般的国产水泵就能满足日常的需要(包括蒸水),但一定注意的是水泵的循环水一定要开,如果不开循环水,水泵中的水很快就会变得很热,将极大地减少水泵的效率,且会将抽出的溶剂挥散出来,很不好! 比国产水泵更好的是进口水泵,比进口水泵更好的是隔膜泵,系统的密闭性就更重要了,特别是蒸像水,丁醇这样的溶剂,对系统的密闭性的要求很高,对于系统密闭性不好时,可采用逐步拆分法来查漏,最容易出问题的地方在垫圈,国产的旋转薄膜配的垫圈很烂,全不耐氯仿等有机溶剂,当用国产的旋转薄膜蒸过氯仿等有机溶剂,垫圈就废了.所以要多预备几个垫圈.
2) 冷凝液一般使用水,如果配一台冷阱,使用半量的水配比上办量的汽车冷冻液, 效果棒极了
3) 提高蒸发温度当然可以提高蒸发的效率,但可能发生物质的变化,国产旋转薄膜,水泵,用水冷,当然就只好提高蒸发温度了
我用东京理化的旋转薄膜,1/2汽车冷冻液冷凝,隔膜泵,蒸水不到45度,很爽!
3 向要蒸的水溶液中加甲醇,使甲醇占到30%,蒸出速度将大大提高!
1 Sephadex LH20柱子被弄脏了，大多数情况下是由于样品没滤, 将柱头堵住,或由于样品的死吸附(一般很少发生),使柱子的柱头部分污染,一般的处理是将被污染的柱头部分的填料弃去,具体做法很简单,只将被污染的柱头部分的填料用玻棒轻轻搅起,倒掉即可,
2 如果柱子整个被污染,如果是将Sephadex LH20用反相被污染，办法如下
依次用水,NaOH-NaCl水溶液，水，甲醇洗涤被污染的柱子。因为是整个柱子被污染，所以污染物一定不会完全死吸附在柱上(如果完全死吸附在柱上，污染物一定会只在柱头部分)，所以用合适的溶剂一定可以将之洗下来。
NaOH-NaCl水溶液配法： 8g NaOH ,30g NaCl， 1000ml水看了上面战友们的讨论，感觉受益菲浅。小弟也来班门弄斧，发言不对之处，请各位兄台指正：
Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。此君既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。虽然价位很高，但由性能颇佳，可再生利用，所以倍受钦睐。此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之一。
我用Sephadex LH-20的步骤是：
1.选择条件：
梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。极性在的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统。我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统，用了很多年，效果较好。
2.饱和层析柱：
用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，此时要防止气泡留在其中。至少半小时打开开关，流出几个柱体种的洗脱剂，目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中。
3.样品处理：用尽量少的洗脱剂溶解样品，常压过滤。
4.湿法上柱。这也是要有技巧的步骤。
5.洗脱：控制流速，一般1drop/s以下，可参见厂家的一些参数;必要时更改极性(很多时一个极性就可以将样品洗脱完毕)。
6.再生以备下次使用。首先谢谢yxssmaster 战友的如许多的贡献
偶也用过一阵SEPHADEX柱，把自己的心得讲讲，希望给大家有用
1。其实我们用的每种用来分离的填料都有它的比较适合的化合物类别，关于这一点，希望能得到yxssmaster 战友的指点 我的植化实战经验不多，但是就我个人认为的：也许SEPHADEX不是很适合分离皂甙类的化合物，因为偶的皂甙上去接了30多瓶，最后算是合并成了一瓶，感觉巨失败
2。用含水的溶剂来作为流动相，很难挥干，如果放的时间长了还会长霉 偶认为比较好的办法是直接拿去冻干，然后再溶解走TLC什么的;条件好的话可以走液相来判断流份了 goophy wrote:
不知道用反响柱分离合用LH-20那个效果比较好.同时如果用同一根LH-20的话,洗脱剂可以从氯仿-甲醇换到甲醇-水吗?还有一个问题,上LH-20的时候可以用一个梯度洗脱吧?最后用甲醇冲柱就可以了吧??
1.Sephadex LH-20主要还是分子筛的作用机理，在非极性溶剂中有一定的反相柱效果。如要分离的物质在反相板上分离效果好，那么大可在反相柱中进行分离;如果要分离的物质分子量相差较大，当然是Sephadex LH-20效果好。实际使用中往往上在一起配合使用，逐渐细分为多个部分直到拿到纯品。
2.Sephadex使用时一般不进行梯度洗脱(洗柱的时候当然要换)。如果改变流动相的极性，会改变凝胶的膨胀率，分量不同的物质在网孔改变过程中引起交错，反而达不到分离效果。如果要分离的样品中极性相差较大，可以细分为不同的极性段再上Sephadex LH-20
