PCR仪

mir实时定量的上下游引物是我自己设计的。
主要是参照Chen2005年的文章，附件中有原文和support文件.
同时曹雪涛院士也是用的锐博的mirna引物，但是他公布了序列，附件中有原文和support文件：
可以仿照设计，并且有自己的miRNA引物序列可供发表文章使用。然后拿到英俊合成的PAGE纯化的引物。
用的也是takala的全套pcr产品。
对于扩增效率只有60%，如果排除了温度的影响，不好意思，我没有什么好的建议，唯一的建议就是换引物。
祝好！
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你好，还有个问题想请教下你。我买的锐博的说明书上有一个rt-pcr的体系，takara也有个rt-pcr的体系，两者体系是不一样的，比如说引物的量，cDNA的量等等，我想请问，你采用的是哪个呢？谢谢指导！

我的做法是先逆转录再荧光定量pcr！
逆转录使用特异性引物（u6的反向引物）。
u6，also as know RNU6A,RNU6B，分别对应 RNU6-1，RNU6-2，
U6 F CTCGCTTCGGCAGCACA
U6 R AACGCTTCACGAATTTGCGT
这个引物是在google学术搜索里面检索出来文献最多的，有多篇cancer reserach高影响因子使用，且经丁香园内朋友使用，反应很好！
在生工合成的，今天pcr结果非常好！U6的ct 13.1左右。
另外，多谢园友提醒，这些u6都是用于人的。不清楚，也没有验证是否可以用于老鼠！
希望能够给大家一点帮助。
对你有帮助的话，请投票支持！对你有帮助的话，请投
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楼主没提探针，您用的是sybgreen 染料吗？

那您跑胶或测序以，除了溶解曲线

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跑胶证明是特异目的产物,未测序。

第二个问题，我当时也考虑过对u6,是进行特异性的反转录（用u6-r），还是用oligo(dT）常规扩增，后来选了只用u6-r做。考虑到既然mirna用了特异性的引物，u6也用特异性的，更具有可比性。

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您好，我是新手，最近要做microRNA的东西，选择染料法，向同学大概了解了一下，但是还是有很多地方不明白。例如您上面讲的特异性反转录，同学告诉我的是在反转录之前需要多一步加A尾，之后就和mRNA一样了，而且可以用mRNA的反转录试剂盒。您上面提到的“进行特异性的反转录（用u6-r），还是用oligo(dT）常规扩增”是什么意思，是扩增的时候只加这条链吗，还是在别的步骤有什么特殊的操作？
另外，我在搜索目的基因序列时找的比较困难，好不容易有篇文献中提供了序列，但是说巢式pcr，然后提供了四条链，分F1 ，F2， R1 ，R2 ，之后我查了相关资料，说是进行两次pcr，没明白是什么意思，现在迷茫中，希望您帮忙解答，万分感谢。