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标题:【求助】关于realtimePCR条件如何摸索？

seagate[使用道具]
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发表于 2015-6-1 21:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 avi317 于 2015-6-1 21:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我用普通的PCR摸索引物的Tm值，最适温度54度，无非特异条带，当我同样的条件做荧光时，却出现了非特异条带，真是太奇怪了，有没有人遇到过这样的情况啊，我快急死了！ ...

荧光定量PCR的敏感性比普通PCR高，出现这种现象并不奇怪。提高退火温度试试看。
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yapuyapu[使用道具]
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发表于 2015-6-1 21:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我在做real-time的时候,用的是基康合成的探针和引物.做avtin的时候发现在平台期出现了锯齿状的曲线,请问是什么原因呢?
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发表于 2015-6-1 21:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 yapuyapu 于 2015-6-1 21:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我在做real-time的时候,用的是基康合成的探针和引物.做avtin的时候发现在平台期出现了锯齿状的曲线,请问是什么原因呢?

这种情况我还没有遇到过。
不知你用的什么机器？我用的是rotorgene2000、3000，曲线都很平滑。我见过别人用ABI7000做的结果，有时会出现锯齿状的曲线，尤其是融解曲线，会不会跟机器分析数据的方式有关。
平台期的锯齿状曲线，应该对结果没有很大的影响。
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小荷尖尖[使用道具]
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发表于 2015-6-1 22:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
的确是，ABI的机子好像存在这种问题，尤其是当荧光信号不高时，曲线会出现波动，偶们这的机子就这样，但应该是不影响结果判断的，只是拿出来结果和其他机子的比要难看许多，据说是因为它的光源不好，按ABI的工程师的话要是经常用的话，应该3个月就换一次灯泡，可这东西也巨贵，所以也只好将就了Sad。或者请工程师来查查吧！祝好运！
对了你用的吉康的探针引物做的怎样？我打算定探针，还没决定是用吉康的还是TAKARA的，希望提供参考意见，谢啦！
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小荷尖尖[使用道具]
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发表于 2015-6-1 22:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

昨天打电话问了abi的工程师，他说当荧光信号比较低时容易出现这个问题，ABI7000的出了新版软件SDS1.1具有修正功能----可以让你的曲线好看----当然他也说了只是好看，不起根本作用，-----不是万能药，主要还是原料要好。偶从网页上下试了试--果然好看些了---它把一些小波动给修平了。Smile
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nikun230[使用道具]
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发表于 2015-6-1 22:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

国内有没有ABI的TaqMan® Assays-on-Demand™ 服务啊? 这个提供全套服务外加优化, 肯定成功的. 我们有同事用过说效果很好.
cuturl('http://www.appliedbiosystems.com/catalog/myab/StoreCatalog/products/CategoryDetails.jsp?hierarchyID=101&category3rd=111951&trail=no')
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yyaxw84[使用道具]
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发表于 2015-6-1 22:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我一直在作real time PCR. 我把我作的一些体会与你讨论一下。我的模板来源于激光显微切割（LCM)的单个神经元，评价一些兴趣基因的表达差异必须用real timePCR. 对于确立最优的real time PCR条件，首先在固定探针浓度，优化引物浓度（300, 450, 600，900nm），确定最佳引物浓度后，应用优化的引物浓度然后再去优化探针浓度（50,100,150,200nm)。第三步，有优化的引物和探针浓度作兴趣基因的扩增效率曲线，即calibration curve，确定PCR扩增效率。如果在你的实验中仅作相对定量，你需要一个内标基因。对于内表基因同样需要优化引物浓度，探针浓度及建立calibration curve。比较兴趣基因与内表基因的扩增效率的斜率回归有无显著性差异。如果没有，可按delta delta Ct计算相对表达量。如果有显著性差异，按Russman计算出相对表达差异。至于real timePCR程序，我认为应该通用的，因为ABI公司配套的primer express设计出来的引物及探针序列均满足此程序。因为Taqman real time PCR非常敏感，所以模板并非越多越好，你可能不相信，在我的实验中我用GAPDH为内标，Ct为29-31，amplification plot 非常平滑，在优化引物的过程中，经常会得到不同的引物浓度组合得到最优的引物，你如果有时间，不妨试一试。希望对你有帮助。
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yyaxw84[使用道具]
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发表于 2015-6-1 22:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我认为你得到的扩增效率超度100，最可能的原因是加样误差，因为real time PCR太敏感。
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ROSE李[使用道具]
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发表于 2015-6-1 22:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你所说的是本底信号没有还是没有扩增信号？
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newway[使用道具]
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发表于 2015-6-1 22:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

各位高手:
我是新手,要作实验了,可对PCR还是“雾里看花” ，主要的问题在于引物设计，
我是作EB病毒的，它有EBNA-1,EBNA-2,EBNA-3,EBNA-4,EBNA-5,EBNA-6,六个核抗原，我以哪个设计引物？还有对与新鲜标本与石蜡切片在设计引物时有无不同？
麻烦相告，谢谢！
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