现从我的角度给您提供以下参考意见：
一、 各位高手：
我是一名新手，打算作real－timePCR，荧光标记是TAMER 和FAM，有几个问题我想请教。
1，能否用一般的PCR试剂盒。
（一般情况下不可以，但我们自己开发的——通用PCR核心试剂盒——可以适用于荧光和普通PCR）
2，我在普通PCR仪中摸索的反应条件与体系能否用于real－timePCR，如果需要改变体系和条件，有没有经验主要以改变什么条件为主。
（ 如采用通用PCR核心试剂盒，微调镁离子浓度（终浓度1.5-5.0mM），按照您原来的程序或我们建议的程序，您可先用普通法看能不能扩出片段；如能扩出，上荧光仪器时仅需要微调镁离子浓度（终浓度3-5.5mM），可以按照我们建议的程序进行扩增，可大大减少您优化体系的时间和费用；
3，是否一定需要内标。
（内标有固然好，但这需要更多的技巧和经验，且和仪器紧密相关。建议刚开始不要用内标）
4，能否请主任和各位高手把你们的protocol发给我参考，谢谢。
（版式不对，在这显示的乱七八糟；需要的人可以给我EMAIL地址，我发过来，我的地址是
transhold@citiz.net）
小妹还有两个问题
1、是否所有resltime pcr均需要标准品，而且标准品是否一定是自己合成序列克隆到质粒表达后提取的DNA，除此以外还有没有别的什么可以充当标准品。
（你也可以用含目的基因的标本的扩增产物纯化后来充当阳性对照，梯度稀释后作为标准品；只是该标准品的保存时间可能不太长，易降解；或合成标准品，该标准品生物特性也有一点不好，易吸附在壁上，梯度稀释后使用前要充分混匀，否则线形不好）
2、teqman探针和sybergreen的区别是什么，两者均需要标准品吗？
（taqman探针原理：在通常的PCR扩增体系中加入一个特异性的荧光探针，该探针为一段寡核苷酸，两端分别标记报告荧光基团和荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增过程中，利用Taq酶5’－3’外切酶活性将探针降解，使报告荧光基团和荧光淬灭基团分离，监测系统便可接收到荧光信号。每扩增一条新DNA链，就有一个荧光探针降解，荧光信号与PCR产物的同步累积。
sybergreen原理：在PCR反应体系中，加入SYBR荧光染料；SYBR荧光染料掺入DNA双链后，能发射荧光信号，而不掺入双链的SYBR分子不发射荧光信号，因此荧光信号与PCR产物同步增加。
二者特异性不同，前者TAQMAN探针增加了扩增的特异性，后者如有非特异性扩增仍能检测出荧光曲线。
其实你只要准备好待检的DNA样品（已经提纯），引物，探针，采用我们的试剂盒就可以上机操作了，来检验或调整体系，看是否有扩增曲线（S型线）；下一步才是制作标准品进行定量的问题。）
紧急求助，希望各位高手给予帮助
小妹还有几个问题想请教：
1、同一台荧光定量pcr仪是否即可以作探针也可以作染料的。 （是的）
2、探针和染料的试剂盒是否一样的。 （做成一样比较难，但我们做到了，我们的热启动荧光PCR核心试剂盒两种体系都可以适用）
3、我要用的是探针，可不可以推荐一些价格便宜一点的试剂盒。（价格只有PE的一半，且是50ul体系）
4、我要扩增的片断是160bp，这种长度能否通过合成制定标准品。 （可以）
5、请问哪里可以找到如何使用纯化样品的PCR产物作标准品的方法的相关资料。（建议：先建立反应体系，再来做标准品）
