PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】关于realtimePCR条件如何摸索？

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 191  3/20 ‹‹12345678910›››|
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】关于realtimePCR条件如何摸索？

caihong[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73197
精华 1
积分 795
帖子 1206
信誉分 102
可用分 6856
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态 离线
21

发表于 2015-6-1 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
哦，原来如此，看来dna对于做定量影响很大。
你的第一个引物这么的差，你都能作出好的结果，不得不佩服。你的现成的protocol是怎么样的能给我发一个吗？shiguiwang@hotmail.com
我还有好几对扩的不是很的引物和探针，我的引物探针扩增不好的主要表现是反应效率很低，并且平台期的荧光强度是本底荧光的2倍都不到，能谈谈你的方案吗？
顶部
bs4665[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75127
精华 0
积分 505
帖子 650
信誉分 100
可用分 4136
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
22

发表于 2015-6-1 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我把protocol写在以前的帖子上了。
我觉得是不是可以调整一下模板浓度，我的都是30ul体系中有10ul的模板。另外你有没有SYBR GREEN的试剂，可以先用SYBR试一试，调整一下program,看看反应效率如何,如果效率不错，至少可以证明你的引物没问题。
还有标准曲线你选了几个点？相邻指数级的质粒DNA大概Ct值相差3.32所有，你感觉是高浓度的扩增效率不好还是低浓度的不好，还是都不好。
顶部
whitesheep[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 78856
精华 0
积分 825
帖子 1330
信誉分 100
可用分 7476
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-4
状态 离线
23

发表于 2015-6-1 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也要做ＲＴ－ＰＣＲ，正在查资料。看了你的帖子，让我学到不少有用的东西，谢谢了！
　　另外，我要请教一下，你说你用的引物是取自别人的文献，可是我发现我查找的资料中用的引物不完全一样，而且有的引物与我从基因库中查找的序列不相吻合，我不知道他们是怎样做出来的。在这种情况下，你能告诉我应该怎么办吗？谢谢！
顶部
whitesheep[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 78856
精华 0
积分 825
帖子 1330
信誉分 100
可用分 7476
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-4
状态 离线
24

发表于 2015-6-1 17:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我新手，准备做荧光定量ＰＣＲ，用杂交探针方法。请问引物和探针在哪家公司设计比较好，他们的联系方式是怎样的？另外，我想将ＰＣＲ产物克隆到Ｔ载体中，是否要将酶切位点告诉给公司？谢谢！
顶部
H2O[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77273
精华 0
积分 434
帖子 547
信誉分 100
可用分 3566
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
25

发表于 2015-6-1 17:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你将作者的引物用BLAST查一下，如果在你的目的基因上就可以用。所有在用别人的引物之前一定要检查一下。
顶部
woshi[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 117885
精华 0
积分 467
帖子 674
信誉分 100
可用分 4121
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-12-7
状态 离线
26

发表于 2015-6-1 17:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

除了Mg之外，引物与探针的比例比较重要，拒本人经验，3：2的比例比较好，Mg以4个nMol/l为好，如可序列中的GC比例较高，可以用GCBuffer。
做PCR时，常常急视反应效率，这个很重要，在做两 条基因或是两个标本的比较时，如果效率不一样，那样的定量结果没有意义。优化反应条件时，其实这是最主要的，对于Real－TimePCR而言，标准曲线的斜率值 越接近3.33为好，这时效率为1。
顶部
bring[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74282
精华 0
积分 597
帖子 914
信誉分 100
可用分 5326
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-9
状态 离线
27

发表于 2015-6-1 17:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

公司给我设计的引物其扩增片段只有57个pb,请问用这对引物做realtimePCR效果好不好?
谢谢!
顶部
H2O[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77273
精华 0
积分 434
帖子 547
信誉分 100
可用分 3566
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
28

发表于 2015-6-1 17:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以，但是有点小，可能会遇到一些困难。
顶部
H2O[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77273
精华 0
积分 434
帖子 547
信誉分 100
可用分 3566
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
29

发表于 2015-6-1 17:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一般都推荐100-150。但是我的最小的是60，优化系统后也出奇的好。
顶部
iii_ii[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114477
精华 0
积分 420
帖子 479
信誉分 100
可用分 3229
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
30

发表于 2015-6-1 17:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问各位，相同的条件，普通pcr结果还可以，为何realtime pcr的标准曲线都作得很不好?我今天做了两个基因结果都是这样，非常非常得郁闷！请各位帮忙
顶部
 191  3/20 ‹‹12345678910›››|