PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】关于realtimePCR条件如何摸索？

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 191  4/20 |‹‹‹234567891011›››|
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】关于realtimePCR条件如何摸索？

iii_ii[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114477
精华 0
积分 420
帖子 479
信誉分 100
可用分 3229
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
31

发表于 2015-6-1 17:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的质粒己经测序鉴定过了的
顶部
H2O[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77273
精华 0
积分 434
帖子 547
信誉分 100
可用分 3566
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
32

发表于 2015-6-1 17:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是什么问题？扩增效率 不好还是其他？你是用SYBR GREEN还是TAQMAN？普通PCR的程序和体系上了REAL TIME 有时还是需要调整的，因为REAL TIME对系统的优化的要求比较高。
顶部
cj_mondy[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76095
精华 0
积分 627
帖子 853
信誉分 100
可用分 5201
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
33

发表于 2015-6-1 17:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的是SYBR GREEN，在普通pcr上能扩出来，但是上realtime居然连标准曲线都没做好。各标准样品的ct值只有第一个梯度的ct值是19，其余各梯度均是24、25左右，而且溶解曲线显示杂峰特别多。另外，各样品的GAPDH的CT值居然也会差很多，理论上我是想把它作为内标的。
现在我是否应该重新摸条件。
1。模板是用质粒，还是用样品？
2。是先摸Mg+浓度，还是退火温度？
3。是否还要摸其它的条件？
3。是用普通pcr摸，还是用realtime摸？
4。因为我原来是想用RT做的，所以扩增片断的长度在250-590bp之间，是否需要重新设计引物？
5。您说的保存cDNA的rRNA溶液是什么？
6。另外再问个傻傻的问题，扩增效率如何计算？
非常感谢您！
顶部
yizhi[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 117886
精华 0
积分 364
帖子 467
信誉分 100
可用分 3071
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-12-7
状态 离线
34

发表于 2015-6-1 17:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也在作，而且也遇到了一大堆问题，现在也还在苦苦摸索中，就我的一点体会real-time Pcr是相当灵敏的，融解曲线如有杂峰那么可能是由非特异的扩增，所以建议作完后跑个琼脂糖电泳看一下，即使是由单一峰也要保证相同的基因其位置一致，因此跑电泳看一下比较保险。而且就体系而言，加了染料还是有影响，我现在发现的问题是，我的相同条件扩GAPDH挺好，但我的目的基因就出现了非特异的扩增还很亮，而且阴性对照曲线也抬头，跑了电泳一看是引物二聚体，而然而在普通PCR则都跑得挺好，所以还得摸一下体系。
不知楼上用的是什么机子？是那个公司的试剂盒？我也是新手，希望多多交流经验。  Beer
我是用的ABI7000的机子，由于是在预试验，所以没用试剂盒，问题就多的要命，扩了大半个月，曲线一直不好，开始怀疑体系不好，又考虑机子不好（虽然买了一年也没几个人用过，可等我要用时就坏了，设备科为了省钱非要自己换零件，修了一个月！真是衰！
Sad）后来怀疑燃料不好，有从新要了管燃料，又让公司的人来调整了仪器，现在曲线是做得漂亮了，但目的基因有扩不出来了！！而且更菜的是出现了污染！ 尤其让我奇怪的是，我的某细胞特异表达的融合基因用另一个细胞的cDNA中也扩出了很亮的带（当然与目的带不一样）！！看样子是我的引物不好？可它们是跨融合基因断点的，不会在两个引物与一个正常基因都用高的同源性吧？！ PCR简直太神奇了！我现在只好尝试自己设计引物看看。但愿我们都好运，早点摸出个好条件！
顶部
cj_mondy[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76095
精华 0
积分 627
帖子 853
信誉分 100
可用分 5201
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
35

发表于 2015-6-1 17:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
好！
我刚看了你以前的几个贴子，深有同感。
我用的是BIO-RAD的机子
现在我的标准曲线都做不好，同时建议我再再普通PCR上摸一下条件
是否用HOTSART TAQ酶效果要好很多？
顶部
H2O[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77273
精华 0
积分 434
帖子 547
信誉分 100
可用分 3566
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
36

发表于 2015-6-1 18:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
说道realtime，怎么说那，刚开始我也是遇到一大堆问题，弄得自己都怀疑课题的可行性。不过realtime比较需要耐心，我觉得各种条件都像是微调，很精细的，当你找到一个很优化的条件后，整个系统都比较稳定了，所以大家慢慢来！
如果有条件可以试一下试剂盒，我用的QIAGEN的SYBRGREEN，价格还可以接受。关键是不用摸什么反映体系，只需要找好温度和时间。这个盒子用的是HOTSTAR。
HOTSTAR TAQ效果不错，值得一试。
顶部
H2O[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77273
精华 0
积分 434
帖子 547
信誉分 100
可用分 3566
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
37

发表于 2015-6-1 18:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也 在作融合基因。不过这个东西实在很神奇，许多机制 要比我们想象的复杂的多，包括PCR，影响的因素太多， 我作出来的东西有些跟想象的正好相反，我现在正在找是实验的原因还是事实就是如此。
顶部
whitesheep[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 78856
精华 0
积分 825
帖子 1330
信誉分 100
可用分 7476
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-4
状态 离线
38

发表于 2015-6-1 18:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

扩增效率计算公式是
首先根据标准曲线的斜率求得-1/slope
得到的数值求作为指数,以10最为底所计算的结果就是E
见此公式
(-1/slope)
E=10
理论上一般slope应该是-3.32,这样得到的E是2,表明每增加1个循环,产物扩增1倍,而理论上slope不会低于这个数,因为PCR不可能超过2倍增长,但是实际好象经常遇到,这说明PCR一些存在问题
顶部
woshi[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 117885
精华 0
积分 467
帖子 674
信誉分 100
可用分 4121
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-12-7
状态 离线
39

发表于 2015-6-1 18:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
前几天我还郁闷不已，现在发现有这多朋友。我又充满了信心！
我刚做了退火温度实验（用质粒做模板的），在普通pcr上发现55-63度对是否有非特异性扩增影响不大。（这和我以往实验结果不太一样）不过这说明我应该摸一下镁离子浓度，以前我用的是1.5，现在看来这个浓度有点底了。听楼上的，从2.0开始摸。
另外，有文献说，当循环数从25增加到34个循环时，实时定量PCR的最低检出限可从106增加到103。是这样么？
顶部
ldh[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 117813
精华 0
积分 276
帖子 291
信誉分 100
可用分 2196
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-12-7
状态 离线
40

发表于 2015-6-1 18:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我新手，准备做荧光定量ＰＣＲ，用荧光染料方法。请问对TAQ酶有特定的要求吗
顶部
 191  4/20 |‹‹‹234567891011›››|