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标题:【求助】关于realtimePCR条件如何摸索？

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发表于 2015-6-1 18:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用了36个循环
基因250bp，延伸时间1min
那我用多少拷贝的质粒呢？
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发表于 2015-6-1 18:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得一般情况下只要系统优化好，10的0次方拷贝数完全可以，如果不放心，你可以从10的0次方做到10的5次方或6次方.
是不是可以试一下加到40个cycles。
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雪原[使用道具]
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发表于 2015-6-1 18:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

其实在36循环内，1000copy以下已经有荧光信号，但是从熔解曲线看，明显不是目的基因
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发表于 2015-6-1 18:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我正在做real-time RT-PCR，对标准品的制备存在一些疑问。我用的是一管两酶法，从理论上讲是不是应该用RNA做标准较为科学？我看大家的贴子中用质粒做标准的很多，有哪些讲究呢？此外我在准备RNA标准品的时候，用的是promega的体外转录试剂盒，可RNA的纯度很低，OD260/OD280经常在1.8或以下，我完全是按照试剂盒的要求做的，不知有哪些地方处理不当。请指教，也请各位战友帮忙提提建议。
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发表于 2015-6-1 18:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想这里大多数战友都是用的两步法，即在普通PCR上RT，然后用cDNA上realtime PCR。这种情况下通常是用质粒DNA作标准品的。一步法我没有做过，但是我觉得RNA标准品的制备、保存、稳定性这几个方面都不如DNA好控制。关于制备RNA，我更是没有什么经验，希望其他战友提些好的建议。
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发表于 2015-6-1 18:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征
关于绝对定量,则需要采用标准品,可以使用质粒DNA或者体外转录的RNA,然后通过测定260和280nm的OD值获取浓度,这里需要考虑一些问题:
(1) DNA或者RNA必须是保证纯,不能有污染(RNA或者DNA),否则OD读数不准确
(2)就是实验者的PIPETTING,这是做REAL TIME最重要的问题,必须保证每个稀释浓度的准确
(3)虽然DNA比RNA稳定,但是用于做RNA的定量,还是应该采用RNA做标准品,然后按照同样的PROTOCOL逆转录,否则这里存在的差异可能影响结果的,而这时对于RNA需注意其稳定性,如有兴趣可以参考下文献
Collins ML, Zayati C, Detmer JJ, Daly B, Kolberg JA, Cha TA, Irvine BD, Tucker J, Urdea MS.
Preparation and characterization of RNA standards for use in quantitative branched DNA hybridization assays.
Analytical biochemistry. 1995 Mar 20;226(1):120-9.
links:
cuturl('http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6W9V-45NJ0NT-8X&_coverDate=03%2F31%2F1995&_alid=128248542&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_qd=1&_cdi=6692&_sort=d&view=c&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=5b2e438af435080494e66a92dfdd7e10')
而目前多数RNA定量依然使用相对定量方法,但是这种方法的前提是TARGET基因和内参照基因的扩增效率必须近似,一般斜率需要在-3.32附近,而两者的差值要在0.1以内
如果用DNA做标准品则这里有一个假设前提就是逆转录效率是一致的.
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发表于 2015-6-1 18:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

上一周,一个师兄让我做一PCR,温度最初给的是58度,但是目的没有达到,后又实验了52和53均没有结果,另一师兄建议我缩短其中几个步骤的时间,摸索出来一个时间后再扩增目的片段!不知道大家怎么看?
(师兄本来要我用菌体做模板的,但是无论是菌体还是质粒都没有结果!)
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发表于 2015-6-1 18:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教主任：
我是real-time的新手，试验的内参用的是b-glublin，师姐给的primer和probe的序列，我就用了，可经real-time在有些细胞里却没有测出表达，回头一查原文章，forwardprimer和probe的序列都有错，但考虑到在有些细胞里还是能够测到表达的，所以想请问到底是是primer和probe影响了我的实验结果？还是b-glublin在有些细胞中确实表达很低？我需不需要重新买引物和探针？
多谢
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发表于 2015-6-1 18:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

传统定量PCR方法简介：内参照法，竞争法，PCR－ELISA法，内标在传统定量中有重要的作用。
相比之下，实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 —— Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ´ SDcycle 6-15 。荧光定量PCR所用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料荧光探针TongueCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。荧光染料:在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
定量聚合酶链反应的研究进展与临床应用.另外，cyc1sbs5 ，可以参考以下的站点看是否有帮助：
中华检验医学杂志2000, 23(2): 120-121.
cuturl('http://www.appliedbiosystems.com.cn/chinese/pe_h2-add1.html')
cuturl('http://www.roche-applied-science.com/lightcycler-online/')
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vvmmoy[使用道具]
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 小中大

我是real-time 的新手，绝对的菜鸟，希望大家各位兄弟姐妹帮我。
我提取的是血中的一种DNA,要绝对定量此DNA,则需要画标准曲线，用标准品（target copy number)，可我不知道怎么提取1000个男性细胞（要精确），有没有简单点的方法？
我的实验的原文作者文章中写:the conversion factor of 6.6pg of DNA per cell was used,for expression of results of copy numbers.
是不是这句话和此有关系，我写信问过他，他没回我，请各位赐教，小妹若有让大家笑，偷偷的笑即可，一定要回答我啊。
SadSadSadSad
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