PCR仪

请教主任：
我是real-time的新手，试验的内参用的是b-glublin，师姐给的primer和probe的序列，我就用了，可经real-time在有些细胞里却没有测出表达，回头一查原文章，forwardprimer和probe的序列都有错，但考虑到在有些细胞里还是能够测到表达的，所以想请问到底是是primer和probe影响了我的实验结果？还是b-glublin在有些细胞中确实表达很低？我需不需要重新买引物和探针？
多谢
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你将你的PRIMER和PROBE在BLAST 上查一下，是不是在目的基因上，如果不在目的基因上，就是能扩出来也不是你想要的。
不过b-glublin的确不是很常用的内参基因，我手头上的资料都没有关于b-glublin，所以我也不太清楚它是不是表达量很低。你作出来的b-glublin平均的拷贝数或CT值是多少？如果你的平均拷贝数已经接近检出最低限，那么你就要增加模板量或者换一个内参基因。

我是real-time 的新手，绝对的菜鸟，希望大家各位兄弟姐妹帮我。
我提取的是血中的一种DNA,要绝对定量此DNA,则需要画标准曲线，用标准品（target copy number)，可我不知道怎么提取1000个男性细胞（要精确），有没有简单点的方法？
我的实验的原文作者文章中写:the conversion factor of 6.6pg of DNA per cell was used,for expression of results of copy numbers.
是不是这句话和此有关系，我写信问过他，他没回我，请各位赐教，小妹若有让大家笑，偷偷的笑即可，一定要回答我啊。
SadSadSadSad
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你要精确提细胞是要做DNA标准品吗？用质粒DNA比较好。

谢谢各位高手指点，这里向大家有礼了！Smile
目前跑细胞株药物作用后的基因表达趋势，觉得real-time还是能做出一点趋势来的，虽然不同锅之间的差异问题还是存在，但是我只有通过不断的重复来肯定所得的结果。不过，我不知道如果要发文章，怎样才算是有科学性的？是给一条曲线，上面标出复管之间的误差线呢，还是发至少三条曲线上去，说明结果是solid的？QuestionQuestion
以我的经验觉得，realtime在结果的可信性上确实存在问题，一次结果实在不能说明问题，我看3次也未必能够。因为实在太不容易稳定了，不同锅之间根本不可能进行统计分析，所以我觉得realtime的统计和传统的PCR肯定是不一样的，比如如何进行临床标本检测的统计？如何进行实验研究的统计。我指的不是简单的阳性阴性，而是数值上的变化和变化所赋予的意义，这点我非常想得到高手的指点！！
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今天才看到这个帖子，不知道回的晚不晚，因为前一阵子我也在做TAQMAN,现在已经作完，我想就我的心得回答你的问题。
我想如果发文章的话，可以不必给出曲线吧，我查过的一些文献就没有，如果要给的话，给出你最能说明问题的即可Tongue
关于你说不同管的误差实在太大，可以通过在一个管内加完样再分装成2或3各管来解决，这可是园友们告诉我的哦Blush，我这样做了，很有效，误差变得小多了Big SmileBig Smile
关于你说的统计问题，我刚开始用的是scheffe's Ftest，感觉效果不是太好，因为我的病例少，不属于正态分布，后来改用mann- whitney进行分析，效果很好，数据变得有统计学意义了。我认为比较适用于不清楚样本是否属于正态分布的数据分析。
以上是我的心得，不知对你是否有帮助！

如果你用样本稀释，只能是相对定量，因为你没法确定样本中基因的拷贝数。但是我认为花这么多钱只做相对定量不太合算。
内参必须要有的。比如你每个样本都用100，000个细胞，但是提RNA 和cDNA合成的效率都不尽相同，这样的出的模板量也不同。起始模板量不同，作出来的基因表达量也没有意义。