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标题:【求助】关于realtimePCR条件如何摸索？

##蒙奇奇[使用道具]
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发表于 2015-6-1 21:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

刚到另一公司合成的探针，不知什么原因一直没有信号？电泳条带很好，我用primer express 2.0设计探针时，探针的tm 值比引物的高10度左右，可是公司合成的探针显示的tm 值却比引物还低，我们这儿的高手说这是因为两者的计算方法不一样，不应受影响。
我不知问题到底处在什么地方?是tm 值的原因吗？还是合成的探针有问题？
探针的问题谁有什么好方法检测吗？
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seagate[使用道具]
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发表于 2015-6-1 21:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的探针是自己设计的吗？可否写出来让大家帮你看一下。
你说刚到另一公司合成的，以前合成过的做出来了吗？
探针的检测好像比较麻烦，我不知道除了上仪器还有没有别的办法检测。不知道主任有没有办法。
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mingming0638[使用道具]
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发表于 2015-6-1 21:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的引物和探针如下：

Primer-F: GCT,GCA,GAT,GCT,GAC,CAA,CTC  
  
Probe :ATC,AAT,AAG,GAA,GAA,GAA,GC
   
Primer-R: GAT,GCT,ACT,GGC,CGC,TGA,AG
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seagate[使用道具]
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发表于 2015-6-1 21:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的问题彻底解决了。我今天发现是在分析设置中有一个参数，本来应该是软件自动设置，但很多时候它根本不会自己调整，而工程师一再告诉我那个设置不要随便调，结果导致我的结果没法分析。我今天自己试着调了一下，又把以前的结果调出来，修改参数后全能分析，害我浪费了两个月的时间。不过现在总算知道问题出在哪儿了。谢谢主任多次指点！！！
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发表于 2015-6-1 21:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
46XX性发育睾丸疾病
xw2318:很遗憾，你的探针的tm 值确实比引物还低，你扫一眼看，引物的GC含量明显高于探针，算的结果是引物高于探针10度。不论你用什么软件计算，可能稍有差异，但结论不会变的。以下是我算得的结果，依次是序列长度，tm 植，GC含量：
F：21 56 57
p：20 46 35
P：20 56 60
另外，探针设计是要选C多于G的序列，如果你的软件给出的是G含量高的那一条，你要用它的互补链做探针。
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mingming0638[使用道具]
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发表于 2015-6-1 21:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我扩增的是融合基因，探针所在的位置即为断裂点所在的位置，这个位置的TA含量很高，所以我选探针时很是费了一番功夫，一直找不到合适的引物，所以出来上述序列时就完全相信了软件。当扩增融合基因时探针时，如探针在断裂点处无疑会增加扩增的特异性，然而在其它位置可以吗？为什么要选C多于G的序列？
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发表于 2015-6-1 21:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

探针C多于G是一个经验的结论，∆Rn值相对较高（与G多于C比）。
探针在其他位置应该也可以吧。既然是为了检测融合基因，引物应该是分别在两段基因上的（融合前的），而且REAL-TIME检测的扩增产物都很短，特异性应该不成问题。另外，不知道你的富含AT的区域有多长，可不可以考虑用杂交探针，设计两条探针分别在融合位点的两侧，特异性也很高的。
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发表于 2015-6-1 21:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是名新手，打算用质粒DNA作标准，请问用质粒做标准与在公司买的标准品有啥区别？如用质粒做标准，是自己做还是拿到公司去做？如自己做的话，一般是怎么做的？等候你的回答
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发表于 2015-6-1 21:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用普通的PCR摸索引物的Tm值，最适温度54度，无非特异条带，当我同样的条件做荧光时，却出现了非特异条带，真是太奇怪了，有没有人遇到过这样的情况啊，我快急死了！
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seagate[使用道具]
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发表于 2015-6-1 21:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用质粒做标准与在公司买的标准品有啥区别？如用质粒做标准，是自己做还是拿到公司去做？如自己做的话，一般是怎么做的？

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公司的技术比较成熟，做的可能更好一些，但估计要花不少钱。自己做也可以，细心一点，准确度也是可以的。一般是把包括目的片段在内的较长的DNA片断插入到质粒载体中，大量转化后得到的。
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