【求助】关于TRIzol提取RNA的工作原理，以及各步试剂...

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标题:【求助】关于TRIzol提取RNA的工作原理，以及各步试剂...

hyuu[使用道具]
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发表于 2015-6-2 15:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我想请问一下，关于TRIzol提取RNA的工作原理，以及各步试剂加入的作用。谢谢

园丁##[使用道具]
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发表于 2015-6-2 15:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

一．  RNA提取
1.  -80oC取标本
2.  取组织
3.  液氮中陶瓷研钵研磨，组织呈粉状时转移到预先称重的5毫升的塑料离心管中，离心管需要DEPC水处理后，灭菌。称重，得组织100mg
4.  加入TRIZOL 1.5ml（-60 oC—-70oC下，可存放1个月）
5.  室温保温5min
6.  加入氯仿0.3ml，盖紧手震动混匀15s
7.  室温2-3min
8.  4 oC，12000g 15min
9.  取上清约0.8ml，转移到1.5ml离心管中，管子处理同上，去净上清的中下层液体用于DNA和蛋白质的提取
10.  加异丙醇0.7ml，混匀，室温下10min
11.  4 oC，10000g 10min
12.  弃上清，加1.4ml 75%乙醇（以DEPC处理灭菌水配制）混匀
13.  4 oC，7000g 5min
14.  弃上清，室温干燥5min
15.  DEPC处理灭菌纯水100ml溶解，-70 oC保存
二．  DNA提取
1.  去净上清的中下层液体约0.6ml，加入100%乙醇0.45ml，混匀
2.  室温下2-3min
3.  4 oC，5000g 5min
4.  去除液体，可保留用为蛋白提取
5.  加入0.1M柠檬酸钠75%乙醇溶液洗涤1.4ml DNA沉淀，室温下30分钟，间断混匀
6.  4 oC，2000g 5min
7.  重复洗涤一次
8.  加入0.1M柠檬酸钠75%乙醇溶液洗涤1.4ml DNA沉淀，室温下15分钟，间断混匀
9.  4 oC，2000g 5min
10.  室温下干燥5-15min
11.  在300-600ml 8mM NaOH中溶解，DNA浓度约为0.2-0.3 mg/ ml
12.  若有不溶物，12000g 10min
13.  上清可以在4 oC存放过夜
14.  长时间保存需要用HEPES加1mM EDTA调整pH至7-8。
三．  蛋白质提取
1.  转移上清到5ml的离心管中，大约体积为1ml
2.  加入2.3ml异丙醇（1.5ml/mlTRIZOL），室温下保温10min
3.  4 oC，12000g 10min
4.  加入3ml（2ml/mlTRIZOL）含0.3M盐酸胍的95%乙醇，室温下20min
5.  4 oC，7500g 5min
6.  重复洗涤3次
7.  加入2ml乙醇，室温下20min
8.  4 oC，7500g 5min
9.  真空干燥蛋白沉淀5－10min，1%SDS溶解
10.  完全溶解需要在50 oC保温，不溶物可4 oC 10000g 10min离心去除
11.  上清转移至新管，可用于Western blotting或－20oC存放

woshi[使用道具]
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发表于 2015-6-2 15:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

TRIzol主要物质是异硫氰酸胍，它可以破坏细胞使ＲＮＡ释放出来的同时，保护ＲＮＡ的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA 和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA 对于样品间标准化RNA 的产量十分有用。
无论是人、动物、植物还是细菌组织，TRIzol法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。TRIZOL试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。故而能够作RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+ 选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。如果是用于PCR，当两条引物位于单一外显子内时，建议用级联扩大的DNase I(Cat.No. 18068)来处理抽提的总RNA。
TRIZOL 试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA 的析出。例如，从大鼠肝脏抽提的RNA 琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7 kb和15 kb 之间不连续的高分子量条带，（mRNA 和hnRNA 成分）两条优势核糖体RNA 条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分子量RNA 介于0.1 和0.3 kb之间(tRNA, 5S)。
提取时需要注意一些问题：提取时要做到超净台内操作、操作带一次性手套、EP管及Tip头都要用0.1%处理（0.1%DEPC浸泡过夜后，高压蒸气灭菌）、小心、细致、晃动及每次移液要轻。这样做的唯一目的就是两个，一是小心RNAse的污染降解RNA；二是动作过度暴力破坏RNA的完整性。
另外你提的RNA做电泳的问题，一般RNA电泳应该是做甲醛变性电泳，但是一般的琼脂糖电泳也可以，需要上样量稍微大些，并且跑电泳的时间越短越好（这样也是为了减少外界RNAse对RNA的降解），跑完电泳立刻观察，这样也可以，但是如果样品中的RNA量很低或者说不是很高的话是检测不到的。

ldh[使用道具]
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发表于 2015-6-2 15:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

mimili_901[使用道具]
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发表于 2015-6-2 15:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

用Trizol进行抽提，基本就是酸性酚抽提法。
RNA提取主要是内源和外源RNase
trizol中有酚和异硫氰酸胍，和B-巯基乙醇
酚能使核蛋白质与核酸解聚（氯仿也可以），酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，可以加入0.1%的8－羟基喹啉，与氯仿联合使用可增强对RNase的抑制。
异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。
B-巯基乙醇主要破坏RNase蛋白质中的二硫键。
加入氯仿，虽然有变性蛋白质的作用，但是其主要用处是用来分相，实际上是加速有机相和水相的分层。一般的trizol试剂在4度下是油状悬浮液，提高温度，放置一段时间，自然也会分相。
上层水相，PH 5.1左右，当溶液pH在酸性的时候，DNA分子就会沉淀在酚与溶液的界面，只有RNA分子留在水相。而当pH接近中性时，DNA就会溶解在水相，（导致PH中性的大概原因是trizol与样品比例不对，应该尽量保证提取量的前提下使trizol过量）
氯仿还可以去除植物色素和蔗糖。在氯仿中加入少许异戊醇目的很简单，为了减少蛋白质变性操作过程中的气泡。
氯仿可以去除核酸溶液中的痕量的酚。
异丙醇沉淀，优点是容积小且速度快，主要沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，对5sRNA、tRNA及多糖不产生沉淀，所以RNA电泳的标志性三条带中5sRNA带很不清楚，未必是你的RNA降解。但是难以挥发出去。
最后的乙醇主要是洗涤异丙醇，也可以溶解一部分蛋白，痕量的乙醇很容易挥发掉。
希望能够对你的问题有所帮助，
也希望版主加分，呵呵

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发表于 2015-6-2 15:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问下，我们说乙醇的作用是用来洗涤异丙醇的，而异丙醇的作用又是聚沉RNA的，那么我们在用乙醇洗涤异丙醇时，不会使异丙醇沉淀RNA的作用讲解吗?如此一来，我们在用7500g离心5分钟，还能彻底将RNA沉淀吗？？刚接触PCR，谢谢哈...

abc816[使用道具]
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发表于 2015-6-2 15:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

RNA 提取的关键是防止RNA酶对RNA的降解作用.
TRIzol的主要成分是酚.主要作用是裂解细胞,使细胞中的蛋白,核酸物质得到释放.同时 TRIzol里加入了可以抑制RNA酶的胍盐.作用自然是抑制RNA酶了.
氯仿可以使蛋白变性 ,降低蛋白的溶解度,
异丙醇是沉淀RNA的,降低了RNA在氯仿中的溶解度.
因为这些试剂都会影响后续实验,所以用酒精洗一到两遍.一是酒精可以溶解一些沉淀中可能的有机物杂质,二是洗掉异丙醇,氯仿试剂,酒精的易挥发性在这里的到运用,
希望说的够具体了好运!!
......

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不知道楼上的还来不来论坛，我想弱弱的问下纯花rna需要从提取完后再加TRIzol+氯仿重来一遍，不可以直接从吸取水相后加入氯仿来减少蛋白吗？刚开始做，迷惑太多，希望高手指点。

BUK[使用道具]
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发表于 2015-6-2 15:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我从组织中提取rna，每次提取的ran浓度都很低，操作均按照trizol提取rna方法来的。用均质机大概要几档操作，我的组织很小。而且均质机每次都会有残留组织在上面，要怎么处理?