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标题:【求助】细胞RNA的提取

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发表于 2015-6-2 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】细胞RNA的提取

本人提取细胞RNA的过程和照片，给初学者，呵呵，贻笑大方。TongueBlush
1、冰冷的PBS液 5-10ml洗涤细胞两次，加入Trizol 1ml，混匀，室温静置15min；这是加入Trizol以后的照片。


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发表于 2015-6-2 15:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
２、小滴管吹打，使细胞完全裂解，然后完全转移至1.5ml EP管内。


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发表于 2015-6-2 15:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

3、加入0.2ml的氯仿，剧烈震荡混匀30s。有人喜欢室温静置10min，有人直接去离心也没问题。偶愿意室温静置10min，看自动分层了，上层水相，下层为酚相。


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发表于 2015-6-2 15:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
46XX性发育睾丸疾病
4、4度离心，15000rpm，15min，看看中间白的是蛋白层，上层为水相。（最上有点红，那是反射光，呵呵 TongueTongue）


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发表于 2015-6-2 15:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

5、将上层水相移至另一EP管内，400-500ul，不要贪多，小心切勿吸到蛋白，加入等量的异丙醇，充分混匀，室温静置10min。然后4度，15000rpm，离心10min，然后管底可以看到RNA噢！看看图，我加了个圈。


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发表于 2015-6-2 15:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

6、弃掉上清，加入冰冷的75%乙醇漂洗两次，用移液器将液体吸干，室温干燥10-20分钟，待产物呈半透明状，加入20ul DEPC处理过的水溶解RNA，你就可以用了。图就不贴了。
提RNA所用试验物品均需经0.1%DEPC水处理后消毒、烤干。所需试剂如75%乙醇需用无水乙醇加灭菌的DEPC水配制，为保证RNA提取过程中，RNA不被空气中RNA酶降解，应勤换手套，戴口罩，这是常识哦。SmileTongue
祝你好运。
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发表于 2015-6-2 15:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用移液器将液体吸干，室温干燥10-20分钟，待产物呈半透明状，加入20ul DEPC处理过的水溶解RNA，你就可以用了

==============================================================================================================

补充一点：移液器将液体吸干后，干燥时间一般10分钟左右即可，干燥时间过长会导致RNA很难溶解。
另：如davidbgb战友所提取的RNA量，最好加入10～20ul RNase Free 水（DEPC处理过的水，也可用高压处理过的双蒸水），以免RNA浓度过低，影响以后的扩增效率。
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发表于 2015-6-2 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
请教一下 ，如果我要提取脑组织海马区的RNA，方法和上面的一样吗，我要做脑缺血后脑组织蛋白的RT-PCR，谢谢楼上，能指教一下吗。
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dior[使用道具]
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发表于 2015-6-2 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
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请教一下 ，如果我要提取脑组织海马区的RNA，方法和上面的一样吗，我要做脑缺血后脑组织蛋白的RT-PCR，谢谢楼上，能指教一下吗。
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发表于 2015-6-2 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我一直在克隆一个基因
提RNA
DNA酶消化
RT－PCR
P内参
P基因
可是几个月过去了，我还是没有P出来，我的RNA提的很好，内参也P出来了，就是自己的基因P不出来，引物是文献上的别人都P出来的。
很郁闷！
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