【求助】实时荧光定量PCR数据统计 - 经验共享

PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】实时荧光定量PCR数据统计

26 2/3 ‹‹1 2 3 ››

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】实时荧光定量PCR数据统计

milkdog[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 79280
精华 0
积分 500
帖子 719
信誉分 100
可用分 4366
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-9
状态离线

发表于 2015-6-3 09:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

设两个复孔也是这样取三个的平均值,如果要用统计方法的话,是把最后的2-ΔCtΔCt 算出来比较异常和正常有无统计学差异吧

========================================================================================

从你的结果看，该基因在正常样品和疾病样品中的表达差异还是挺明显的。感觉样本量少，正常和疾病各才三个

PCR[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 74238
精华 0
积分 414
帖子 448
信誉分 100
可用分 3201
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-8
状态离线

发表于 2015-6-3 09:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 milkdog 于 2015-6-3 09:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
设两个复孔也是这样取三个的平均值,如果要用统计方法的话,是把最后的2-ΔCtΔCt 算出来比较异常和正常有无统计学差异吧
...

谢谢,我的样本不只是这些的,我只是想知道怎么计算的,我看有的计算方法不是只是拿正常1号的作为参照,是把所有的正常的ΔΔCt做为参照,那样是一对一的,我想这有什么区别阿

milkdog[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 79280
精华 0
积分 500
帖子 719
信誉分 100
可用分 4366
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-9
状态离线

发表于 2015-6-3 09:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

参照是认为设定的，选择参照不会影响最终的分析结果，把所有正常样本作为参照，就是把所有正常样本的ΔCt作生物学平均，然后疾病样本的平均ΔCt与之比较得出表达量的情况。

junhun[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77185
精华 0
积分 561
帖子 781
信誉分 100
可用分 4746
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-14
状态离线

发表于 2015-6-3 09:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

是不是所以样本的内参CT值差异不能很大。要是差异很大，需重新做实验，或者，可以将同一样本的内参和目的基因CT值同时放大，这样做的目的是将所有样本内参CT都扩到一个相同的数值。这样可以吗？谢谢了

vvmmoy[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 79224
精华 0
积分 825
帖子 1270
信誉分 100
可用分 7255
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-8
状态离线

发表于 2015-6-3 09:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

先讲讲内参的作用：
内参主要用来校正起始模板量差异以及后续处理中带来的人为差异，相当于数据处理中常用的归一化。
我举个例子说吧：
有A、B两个样本，A样本是从10万个细胞抽提RNA逆转成cDNA做模板，B样本是从20万个细胞抽提RNA逆转成cDNA做模板，我们要看这两样本中某一基因的表达差异，选GAPDH基因为内参。不考虑其他因素影响的情况下，如果A样本的内参Ct值为20的话，B样本的Ct值就是19（2倍差异），同样，假设A、B样本中目的基因表达量一致的话，A样本目的基因Ct值为25，那B样本的Ct值就为24，然后计算各自ΔCt为-5，ΔΔCt为0，得出A、B样本表达量一致。
如果内参Ct值差异大，要具体问题具体分析，先看三个重复的Ct值差异（尽量控制在0.5以内），复孔没问题时，如果采用染料法，再检查熔解曲线是否正常，如果这些都没有问题就不需要重做了。
Ct值的大小由定义的阈值决定，阈值可以在扩增曲线的指数增长期任意人为设定，所有Ct值的大小本身没什么意义，ΔCt（样本目的基因和该样本内参Ct值的差值）才是恒定的。

小游abc[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 108891
精华 0
积分 256
帖子 231
信誉分 100
可用分 1911
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态离线

发表于 2015-6-3 09:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 vvmmoy 于 2015-6-3 09:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

先讲讲内参的作用：
内参主要用来校正起始模板量差异以及后续处理中带来的人为差异，相当于数据处理中常用的归一化。
我举个例子说吧：
有A、B两个样本，A样本是从10万个细胞抽提RNA逆转成cDNA做模板，B样本是从20万个细胞抽 ...

您好前辈，我想问一下为什么A、B样本从不同数量的细胞中提取就像您说的数量差是两倍，为什么就会产生Ct值得相差为一啊？而且您已经让基因表达量一致了，然后打比方A样本目的基因Ct值为25，那B样本的Ct值就为24？就是总体没明白，您能不能再帮我讲讲？初学PCR小菜鸟一枚~谢谢

junjie05[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 79902
精华 0
积分 450
帖子 560
信誉分 100
可用分 3646
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-17
状态离线

发表于 2015-6-3 09:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征