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标题:【求助】溶解曲线是什么?

shkudo[使用道具]
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【求助】溶解曲线是什么?


rt-pcr中溶解曲线是干什么的,是如何测量出来的?说详细点,谢谢!
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remenb[使用道具]
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融解曲线是用来验证扩增产物特异性的,如果产物是单一条带,融解曲线就会出现一尖峰;如果有引物二聚体或其它非特异性扩增,就会出现至少两个尖峰。
ABI 7500做融解曲线的原理是检测从60度到95度,每升一度时的荧光强度。当达到某一温度时,扩增产物双链全部打开(忘了是全部还是50%),就会出现一个尖峰(是经过某种运算换算过来的)。
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shkudo[使用道具]
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谢谢您,但是我还是有些不太明白,Tm应该是50%解链温度吧,是通过那种运算换算出来的?是如何探测到荧光强度的,我做的是Taqman探针的荧光定量PCR,没有延伸就没有荧光的增加,难道还要加东西?
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kulee[使用道具]
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在定量 PCR实验过程中,经常可以使用熔解曲线来进一步分析反应产物的特性。一般是在整个反应结束后,加设一段升温 降温程序:
以SYBR GREEN I 染料为例,这种非特异性结合 dsDNA 的染料,也可能和反应中的引物二聚体非特异性结合,而释放荧光信号,会导致仪器检测的信号不仅仅是目的基因的,所以需要在反应结束后设定一个升温过程,然后慢慢把温度降下来,因为不同DNA片段的解链温度不同,这时若PCR产物纯,则只会出现一个荧光峰,因为只有一个温度值,若有杂质,则会出现其他峰值,这是一个特异性检测方法。
另外,杂交探针试剂也可以用熔解曲线分析,作为 GENO TYPING 的一个方法
最近,有一种新技术 HRM 高分辨率熔解曲线,使用高饱和荧光染料 应用于 SNP分析,比如 RESO LIGHT 染料
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S6044[使用道具]
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用Taqman探针做RT-PCR时,不需要做融解曲线,Taqman探针本身就可以保证扩增的特异性。
用染料时,正常的熔解曲线是一条逐渐下降的曲线,到50%双链打开时,曲线的斜率会突然改变,经过换算后的熔解曲线在此温度处呈一尖峰。
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shenkunjie[使用道具]
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辈 我做的一个小鼠的内参基因 标准品和样品如图 但是结果凌乱了 求解 谢谢
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bring[使用道具]
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若用罗氏480做HRM基因分型出现溶解曲线双峰,会不会是因为是杂合子的缘故出现双峰呢?谢谢
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