PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】请问荧光定量(相对定量)比较Ct中如何计算...

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

标题:【求助】请问荧光定量(相对定量)比较Ct中如何计算...

vcve[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76131
精华 0
积分 743
帖子 1043
信誉分 101
可用分 6126
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
1
 

【求助】请问荧光定量(相对定量)比较Ct中如何计算...


我用 Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method Methods. 25, 402, 2001文中的方法,文中关于判定扩增效率一致的方法,就是用斜率的方法我没有看明白,请问哪位高手解释一下?谢谢
顶部
bs4665[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75127
精华 0
积分 505
帖子 650
信誉分 100
可用分 4136
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
2
 

比较Ct不能计算扩增效率,扩增效率是由斜率决定的
顶部
bs4665[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75127
精华 0
积分 505
帖子 650
信誉分 100
可用分 4136
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
3
 

比较Ct不能计算扩增效率,扩增效率是由斜率决定的
顶部
woshi[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 117885
精华 0
积分 467
帖子 674
信誉分 100
可用分 4121
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-12-7
状态 离线
4
 

我是这样理解的,在扩增效率一致的情况下,相同浓度的内参和目的基因的∆ CT基本上是相同或很接近的,因此梯度稀释的几个点上的差值基本上在一条直线上,因此其斜率很小,接近零。
顶部
xevin[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76455
精华 0
积分 799
帖子 1176
信誉分 101
可用分 6807
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态 离线
5
 

我帮忙翻译一下吧,不对之处还请各位战友指正。该段原文见文章图1下文字。
翻译:
应用ΔΔCT法,目的基因和参照基因的扩增效率必须大体一致。可以用一种灵敏的方法,该方法是通过检测模板梯度稀 释时的CT值变化,来评价两者是否有相同的扩增效率。图1 是cDNA在100倍稀释范围之内的实验结果。每一个稀释梯度的cDNA,c-myc和GAPDH都用特异性的引物和探针检测。由此得到c-myc和GAPDH的平均CT值以及ΔCT (CT,myc- CT,GAPDH)值。cDNA稀释倍数的log值与ΔCT值的曲线图见图1 。如果该曲线的斜率接近0,说明目的基因和参照基因扩增效率是相似的。ΔΔCT法也能够被使用。如图1所示,该曲线的斜率示0.0471,因此斜率接近0的假设成立,ΔΔCT法也可能可以用于分析这些数据。假如两者的效率并不一样,分析就应该通过绝对定量的标准曲线法进行。也可以重新设计引物或优化条件使得两者扩增效率达到相同。
备注:
需要平均CT值,看来每个稀释梯度也是需要同时做几个样本的。
顶部
bring[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74282
精华 0
积分 597
帖子 914
信誉分 100
可用分 5326
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-9
状态 离线
6
 


QUOTE:
原帖由 xevin 于 2015-6-3 16:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我帮忙翻译一下吧,不对之处还请各位战友指正。该段原文见文章图1下文字。
翻译:
应用ΔΔCT法,目的基因和参照基因的扩增效率必须大体一致。可以用一种灵敏的方法,该方法是通过检测模板梯度稀 释时的CT值变化,来评价两者 ...

但我想矫正其中的一点笔误,那就是只有当斜率接近0时才能表明几个相关基因的扩增效率基本一致或相似。
顶部
xevin[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76455
精华 0
积分 799
帖子 1176
信誉分 101
可用分 6807
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态 离线
7
 


QUOTE:
原帖由 bring 于 2015-6-3 16:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

但我想矫正其中的一点笔误,那就是只有当斜率接近0时才能表明几个相关基因的扩增效率基本一致或相似。

的确是0不是1~
顶部
langlang[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77033
精华 0
积分 668
帖子 976
信誉分 100
可用分 5741
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态 离线
8
 

Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method Methods. 25, 402, 2001
请问原文在哪里啊!
顶部
caihong[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73197
精华 1
积分 795
帖子 1206
信誉分 102
可用分 6856
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态 离线
9
 
我看过这篇文献,但是还是不太明白
我打算用用ΔΔCT法,实验将cDNA稀释成五个稀释度:1、1/4、1/16、1/64、1/256,同时扩增目标基因和内参。数据分析的时候(cDNA稀释倍数的log值与ΔCT值的曲线图),应该以什么作为x轴呢?1、1/4、1/16、1/64、1/256还是1、4、16、64、256的ln值,还是其他??
另外,在excel里作图时,趋势线类型应该选择线性还是对数呢?
顶部
youyou99[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75216
精华 0
积分 583
帖子 765
信誉分 100
可用分 4756
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
10
 

请问一下楼上的各位战友:目的基因和内参基因的扩增效率是否一致是由什么决定的呢:引物设计还是基因片段的本身的性质?如果不一致,可否通过什么方法优化条件使之保持一致呢?
顶部