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标题:【求助】一个做qPCR时RNA和cDNA浓度的问题

ns5fan[使用道具]
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发表于 2015-6-3 17:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我设了复孔，去除了点样的误差，这样的CT值差别应该不大吧？
而且我每次的步骤都是固定的，每次的GAPDH组CT值都在18左右，很稳定。
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bs4665[使用道具]
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发表于 2015-6-3 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
保险的做法就是,在后期数据处理的时候,把所有内参都设定为1,在这种情况下,理论上待检基因的表达应该是真实的.
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ns5fan[使用道具]
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发表于 2015-6-3 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
遇到一个问题：
实验室里有同学做这个实验时，在qPCR前再次测所谓的浓度，“重新定量”，最后跑出来的结果是：内参CT值大小不齐，而目的基因的CT值都差不多大小。
有高手能解释一下吗？我只知道这样做肯定不科学，但不明白为什么。
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发表于 2015-6-3 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们实验室的做法同上，RT前定量，去=取1ul反应产物上Q-RT-PCR.结果内参还是很齐的，最后用双Delta，以control组的相对表达量为1，得出目的基因的表达变化。
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发表于 2015-6-3 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我同意用内参校订的方法，但我也认为初始浓度还是初步均一一下为好，否则，假定一个比较极端的情况，一个用了50ngRNA，一个用了5ugRNA，同样的RT反应，其他成分添加的一样多，逆转录的效率能一样吗？而且接下来的PCR过程中，内参的Ct值如果差了5－6，那么同样可以推出PCR过程中模板量差距很大，那么PCR 过程的扩增效率也有很大差异，这样即使扣除内参，你觉得数据可信吗？
我最近遇到的怪事情是RNA浓度已经相对很一致，但是内参的Ct差了4，所以现在我不知道待测基因扣除内参来进行比较的结果可不可靠。或者真的是我的“内参”不是真的稳定？那也差太多了，正苦恼中..........
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发表于 2015-6-3 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用分光光度计测RNA的含量其实是比较不准确的，OD280的读数与杂质含量关系很大。同时，不同样品杂质含量差异可能会比较大，会引起反转录效率不同。这解释了既使RNA含量一样，realtime PCR后内标基因的Ct差异可能会有差别。如果cDNA模板差异过大，通过delta delta Ct计算得到的结果是相当不可靠的。个人觉得样品间内标基因Ct差值应该在1以内，最好是0.5。
如果有人问，要是内标基因Ct差值大于1怎么办？很简单，稀释cDNA模板。我的经验是，Ct差值为1，稀释cDNA模板1.8-2.2倍。这个需要摸一下，多做几次。
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发表于 2015-6-3 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
利用OD260/OD280来调整RNA的浓度只是为了尽可能得到比较统一的扩增效率，但是RNA模板中的成分很复杂，不同样本中的PCR抑制因子的含量也不同，得到的cDNA的浓度可能仍然不一样，不过这些都不影响后期结果的处理，利用内参基因双delta计算公式就是为了校正不同样本中的浓度不同。不同样本内参基因的Ct不同，很正常，如果每一个都一样才叫奇怪呢，内参基因也就失去它的价值了！不同样本的内参Ct不可能一样，但是同一样本的重复间一定要相差不大！
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dog002[使用道具]
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发表于 2015-6-3 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人认为
反转录前必须要测浓度，不同浓度的RNA反转录效率不同，并且试剂盒说明RNA量不要超过一定浓度。不测浓度怎么知道是不是超过浓度限制。一般来说，总RNA量相同，反转录后PCR内参基本平行，因此不需要测cDNA浓度。但也有内参基因不平行的情况，缺氧处理时就常出现这种情况。如果总RNA量相同而内参不平行，可能是内参有问题，没有绝对的内参，可以更换内参试试。因此不测浓度，只用内参相对定量是不科学的，要在RNA总浓度一致并且内参也比较平行的情况下才能相当定量。
和Northern类似，要把样品量调一致再上样是同样的道理。
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dog002[使用道具]
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发表于 2015-6-3 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我同意用内参校订的方法，但我也认为初始浓度还是初步均一一下为好，否则，假定一个比较极端的情况，一个用了50ngRNA，一个用了5ugRNA，同样的RT反应，其他成分添加的一样多，逆转录的效率能一样吗？而且接下来的PCR过程中，内参的Ct值如果差了5－6，那么同样可以推出PCR过程中模板量差距很大，那么PCR 过程的扩增效率也有很大差异，这样即使扣除内参，你觉得数据可信吗？
我最近遇到的怪事情是RNA浓度已经相对很一致，但是内参的Ct差了4，所以现在我不知道待测基因扣除内参来进行比较的结果可不可靠。或者真的是我的“内参”不是真的稳定？那也差太多了，正苦恼中..........
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建议更换内参试试。
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dior[使用道具]
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发表于 2015-6-3 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

同样的细胞，不同处理后，提取RNA，做qPCR相对定量，内参基因的CT值有一两个处理组相差比较大，其他基本没什么差异，这样结果可靠吗？是不是只要看待测基因扣除内参来进行比较就可以？不同组内参基因的CT值要一样吗？谢谢
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