PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】引物稀释

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 17  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】引物稀释

JK.jon[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75188
精华 1
积分 528
帖子 652
信誉分 102
可用分 4146
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
1

发表于 2015-6-3 18:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】引物稀释


各位高手请教一个小问题,新引物如何稀释?谢谢Smile
顶部
cj_mondy[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76095
精华 0
积分 627
帖子 853
信誉分 100
可用分 5201
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
2

发表于 2015-6-3 18:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

记得管上会写是几个OD吧,还有就是几个nmol,我要是没记错,应该是这样的,如果管子上写3.9nmol,那么你就可以加39μl的水,就变成了100μmol/l的储存液了，然后使用的时候再稀释２０倍就变成５μmol/l，就可以使用了啊
顶部
zzzz[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74598
精华 1
积分 656
帖子 967
信誉分 102
可用分 5638
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-12
状态 离线
3

发表于 2015-6-3 18:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

举例如下：根据你合成报告单上的说明（生工）附注中所示每OD的引物加XXul的缓冲液配成100uM的储存液。假如我的合成报告单上附注，每OD的引物加55ul的缓冲液配成100uM的储存液,而我的PCR体系要求引物浓度是2.5uM，那我先稀释4倍，就是加220ul的水到干粉（稀释前要离心，使干粉到管底），然后再每次用时，再拿其中的一部分，分装稀释10倍就可以了
注意引物最好不要多次冻溶，这样易降解。如果试验中发现引物效率降低，既以前p的很亮，现在不亮了，要重新配置引物，减少实验耽误时间。如果发现引物二聚体明显，可以考虑在高温条件下把引物煮一下！
顶部
woshi[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 117885
精华 0
积分 467
帖子 674
信誉分 100
可用分 4121
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-12-7
状态 离线
4

发表于 2015-6-3 18:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问缓冲液用超纯水还是用DEPC水?多谢了!
顶部
newway[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76575
精华 0
积分 505
帖子 689
信誉分 100
可用分 4253
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态 离线
5

发表于 2015-6-3 18:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 woshi 于 2015-6-3 18:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问缓冲液用超纯水还是用DEPC水?多谢了!

您所说的缓冲液是指什么？是指溶解引物的吧？一般都是用超纯水或者TEbuffer来溶解，不要用DEPC水，DEPC水呈弱酸性，oligoDNA容易在酸性溶液中降解，不利于保存，我们都是用灭菌的双蒸水溶解，溶解前干粉离心，让干粉沉在管底，加溶液后振荡混匀，保存一年都还可以使用，使用前充分溶解，关键是双蒸水不要偏酸和不要反复冻融，最好将大管分装成几管使用。
顶部
JK.jon[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75188
精华 1
积分 528
帖子 652
信誉分 102
可用分 4146
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
6

发表于 2015-6-3 18:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

多谢了,对,我说的缓冲液就是溶解引物的,我用的是超纯水,后来想想DEPC不错,因为DEPC是消除RNA酶的,如果做RT的话,引物里边如果含有RNA酶就不行了,超纯水是否经过RNA酶处理也不能保证,所以我认为DEPC更好!请多多指教!个人意见!呵呵!
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
7

发表于 2015-6-3 18:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不能用DEPC水，因为PCR反应是在弱碱性条件下进行的。
我建议先用PH=8.0的TE溶解成100uM的母液，用时在根据需要稀释成5-10UM。
顶部
小鱼鱼[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 73389
精华 0
积分 276
帖子 331
信誉分 100
可用分 2361
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-22
状态 离线
8

发表于 2015-6-3 18:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也来说两句。以下的问答转自上海生工的技术支持内容：
—————————————————————————————————————————
2.怎样溶解引物？
我们的的合成报告单给出了每OD引物稀释为100μmoL/L（即100pmol/ul）浓度的加水量，您可以根椐您的实验需要加入适量的无核酸酶的双蒸水（PH>6.0）或TE缓冲液（PH 7.5-8.0），开启瓶盖溶解之前最好在3000-4000转/分钟 的转速下离心1分钟，防止开盖时引物散失。
—————————————————————————————————————————
其中所说的“无核酸酶的双蒸水（PH>6.0）”我个人的意见是：它就是DEPC处理水（经高压后就无RNase酶）。但PH值是否>6.0我还没来的及检测。不知大家对于这个问题有何看法？
顶部
remenb[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75236
精华 0
积分 631
帖子 941
信誉分 100
可用分 5531
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
9

发表于 2015-6-3 18:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

融解引物的话使用超纯水就足够了（按照我们实验室的习惯，将超纯水装瓶子里灭菌后使用），不需要用DEPC水。因为DNase的稳定性远不如RNase，只要高温处理就可以灭活。
当然如果引物是反转录中cDNA第一链合成时使用，或者一步法RT-PCR就需要使用DEPC水。不过如果cDNA第一链已经合成了，用这个cDNA作为引物跑PCR的引物不需要用DEPC水，因为此时已经不需要担心RNA降解了。
对于一般引物融解方法，个人比较同意楼上 岸上的鱼 战友的说法。DNA在酸性条件不稳定，引物降解对PCR效率影响很大的。
顶部
remenb[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75236
精华 0
积分 631
帖子 941
信誉分 100
可用分 5531
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
10

发表于 2015-6-3 18:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用这个cDNA作为引物跑PCR的引物不需要用DEPC水，因为此时已经不需要担心RNA降解了。

=======================================

上面写错了，应该是用这个cDNA作为模板...
顶部
 17  1/2 12››