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标题:【讨论帖】引物质量直接影响PCR结果

is2011[使用道具]
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发表于 2015-6-5 09:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
天,那我一直没做出来是不是生工引物问题哦
还让我等了很久的呢
再做几次看看
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am10[使用道具]
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发表于 2015-6-5 09:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

上海生工的引物是有问题的，我做了克隆一直不表达蛋白，后来一测，一端少了一的ATG的A，一端TAC的C变成了G，啊，我半年的时间就这样浪费了，因为引物合成时间较长，就没有和他们计较了，现在我们实验室都　不从上海生工订任何东东了，态度差，质量不行的公司能生存吗？
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qianqin1977[使用道具]
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发表于 2015-6-5 10:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
02年时做实验用了一家公司的引物,花费了我2个多月时间,其他的各种资源耗费先放在一边不谈,关键是让带我的老师对我产生了不信任,认为我是要走的人了,不好好做实验了.事实完全不是这样的,当时我一心想把活干得漂漂亮亮,走的开开心心和心安理得.总之离开单位时总有一些别扭.之后换了个同学从新开始做,搭进去了3个月时间,但没有丝毫进展.再找遍所有可能出错的原因后,真凶浮出水面,就是引物合成出了差错,少了一个碱基.害人不浅,人力\物力\信誉,引物之毒害可见一斑.时间过去有将近5年了,这种歪风邪气依然横行,呜呼哀哉,让我辈甚感失望.看来这个市场不肃杀一批假冒伪略是不行的.
呼吁园子里的各位同仁坚决抵制和打压伪略产品的市场生存空间,让这个市场真正规范起来,借用一句广告词:大家好才是真的好.呼吁大家都出一份力,不让悲剧一次次的重新上演.
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发表于 2015-6-5 10:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也出现过同样的引物错误，当时是在博亚，现在的英骏，不过出现问题后公司虽然重新合成，当时浪费了很多时间，这个是无法挽回的
希望公司能引起重视
如果事情大一点，公司肯定还会重视
记得上海的一个博士还做很多同位素，最后发现是引物问题，白白的被辐射了好几个月
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园丁##[使用道具]
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发表于 2015-6-5 10:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
目前质量最有保障的方法是质谱检测，你可以清楚地看到你的引物中有多少有碱基缺失，多少有碱基错配。次一点的，可以选择毛细管电泳检测。
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园丁##[使用道具]
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 小中大
引物的浓度 和质量不能用琼脂糖电泳来检测（不知道你是不是这样检测的），因为琼脂糖EB染色检测的是双链DNA，只有在引物形成二级结构的情况下才能看到，所以不同引物形成二级结构数量不同，染色观察到的浓度就大不相同。
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园丁##[使用道具]
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发表于 2015-6-5 10:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得表达蛋白之前先做测序，比较保险，还是比较常规的思路。在起始密码字的位置出错的，有很多，很致命。
最后，在引物中发现错误是必然会有的，哪家公司都是，只是比例高低的问题，遗憾的是，现在国内公司合成引物的纯度越来越低了，所以测序发现错误的也越来越多。也许有的同学会发现换一家公司就好了，其实说不定哪一批引物也碰到质量问题，这其实就是个概率问题。当然，有时候某一批引物质量特别差，就会出现楼主所说的问题。
建议：如果急着出实验结果，连接转化完之后直接挑2－3个克隆去测序，不要去跟公司讨论什么测序费用谁出的问题了，没用的，现在国内引物合成的现状就这样。多挑几个测序，看似花钱多，实际上后面省心很多。如果是长引物（60bases左右），首先特别不建议合成，实在没办法，那就只有多挑克隆，挑上四五个才找到正确的是 很平常的事情。
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发表于 2015-6-5 10:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

02年时做实验用了一家公司的引物,花费了我2个多月时间,其他的各种资源耗费先放在一边不谈,关键是让带我的老师对我产生了不信任,认为我是要走的人了,不好好做实验了.事实完全不是这样的,当时我一心想把活干得漂漂亮亮,走的开开心心和心安理得.总之离开单位时总有一些别扭.之后换了个同学从新开始做,搭进去了3个月时间,但没有丝毫进展.再找遍所有可能出错的原因后,真凶浮出水面,就是引物合成出了差错,少了一个碱基.害人不浅,人力\物力\信誉,引物之毒害可见一斑.时间过去有将近5年了,这种歪风邪气依然横行,呜呼哀哉,让我辈甚感失望.看来这个市场不肃杀一批假冒伪略是不行的.
呼吁园子里的各位同仁坚决抵制和打压伪略产品的市场生存空间,让这个市场真正规范起来,借用一句广告词:大家好才是真的好.呼吁大家都出一份力,不让悲剧一次次的重新上演.
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gmt[使用道具]
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发表于 2015-6-5 10:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

生工真是害死人呀！！！
偶以前也一直在生工合成引物，但今年9月份左右出事后就再也不去他们那边了。那次是我合成了4条引物，然后回来就是p呀，连接什么的，等测序时才发现给我错了两条。其中一条是多了一个碱基，另一条错误的是一个碱基突变。为了证明是他们家合成出错，我又换了家测序，结果还是如此，哭呀！！
跟他们吵了半天，最后索赔的结果是重新合成序列，并赔我在那里6次测序～～～不过想想这其中浪费的时间和精力，至今仍是耿耿于怀！
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xue258[使用道具]
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发表于 2015-6-5 10:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不是吧，我一直都用上海生工的引物，本试验室还有其他人用英骏的引物，但也没听人说生工的东西这么经不起考验阿。我们做不出来的时候一般都怀疑引物设计的问题而重新设计引物，从来都没有考虑是它们合成出了差错。如果真是楼主所说这样，那真是很恐怖额
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